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SPECIAL WIRKSTOFFANALYTIK

Extraktion von Arzneistoffen aus biologischen Proben

08.11.2005 | Autor / Redakteur: ANDREA JUNKER-BUCHHEIT, UTE BEYER * / Marc Platthaus

Bei der Probenvorbereitung von biologischen Proben bieten monolithische SPEC (Solid-Phase Extraction Concentrator) Disk-Membranen eine wichtige Alternative zu herkömmlichen Festphasen Extraktions-Säulen.

Bei der Probenvorbereitung von biologischen Proben bieten monolithische SPEC (Solid-Phase Extraction Concentrator) Disk-Membranen eine wichtige Alternative zu herkömmlichen Festphasen Extraktions-Säulen. Dazu tragen nicht nur wirtschaftliche Aspekte wie Zeit- und Lösemittelersparnis bei, sondern vor allem die hervorragende Reproduzierbarkeit hinsichtlich Wiederfindungsrate und Flussrate sowie das Vorliegen reiner Extrakte. Dies gilt besonders für High-Throughput-Fragestellungen.

Die Festphasen-Extraktion (SPE) hat sich bei der Vorbereitung von Proben unterschiedlicher Matrixzusammensetzung als Methode der Wahl etabliert. Typischerweise werden Fertigsäulchen eingesetzt, die entweder reines Kieselgel, modifiziertes Kieselgel oder Polymere als Sorbens enthalten. Kieselgelbasierende Sorbentien weisen eine durchschnittliche Partikelgröße von 40 µm auf, wodurch die Anwendung von Vakuum oder positivem Druck zur Erzeugung einer gleichmäßigen Flussrate erforderlich ist.

Zudem sind bestimmte minimale Lösemittelmengen für Konditionier-, Wasch- und Elutionsschritt notwendig, die sich aus dem Totvolumen der Kieselgelpackung ergeben. Vor allem bei Verwendung von 96-Well-Mikrotiterplatten und automatischer Arbeitsweise mit Pipettierrobotern ist eine homogene Packung des Sorbensbettes erforderlich, um eine gleichmäßige Flussrate zu erzielen und das „Channelling“, d.h. das Durchbrechen von Analyten ohne Retention, zu verhindern.

Eine Weiterentwicklung der herkömmlichen Phasen auf Basis von partikulären Sorbentien stellt die Membrantechnologie dar. Hierbei werden monolithische Glasfasermembranen in Diskform mit funktionalisiertem Kieselgel verwendet. Insbesondere bei der Aufgabe kleinvolumiger Proben sind diese Membrankartuschen im Hinblick auf Lösemittelersparnis, Reinheit der Extrakte und Reproduzierbarkeit der Wiederfindungen konventionellen Kartuschen eindeutig überlegen. Es lässt sich somit hoher Probendurchsatz bei reproduzierbaren Wiederfindungsraten mit 96-Well-Platten erreichen.

Diskmembrane

Abbildung 1 zeigt den prinzipiellen Unterschied zwischen konventionellen SPE- und den SPEC-Fertigkartuschen. Anstelle des partikulären Sorbens wird in die Kunststoffkartusche ein monolithischer Träger eingesetzt, der auf einer mit Kieselgel beladenen Glasfasermembran basiert. Es handelt sich dabei um ein hochporöses Kieselgel mit Makro- und Mesoporen. Die Makroporen bewirken einen schnellen und gleichmäßigen Fluss. Somit ist die Gefahr des Verstopfens bei Aufgabe von viskosen und partikelbehafteten Proben deutlich reduziert. Die Mesoporen mit 7 nm Porenweite sorgen mit ihrer großen inneren Oberfläche für maximale Wechselwirkungen zwischen Analyten und funktionalisiertem Kieselgel. Das Totvolumen dieser Membranen beträgt ca. 50 µL bei 15 mg Sorbensmasse. Daher sind nur geringe Lösemittelmengen für die einzelnen Arbeitsschritte erforderlich.

Die Praxis zeigt, dass die fünf- bis zehnfache Menge des Totvolumens genügt, um gleichmäßig zu konditionieren. Damit liegen Konditionier-, Wasch- und Elutionsvolumina zwischen 250 und 500 µL. Diese Membranen sind sowohl in herkömmlichen Kartuschenkonfigurationen und verschiedenen Sorbensbettmassen als auch in 96-Well-Mikrotiterplatten verfügbar. Es gibt eine Vielzahl von Oberflächenmodifikationen, die eine gezielte Methodenentwicklung im Hinblick auf maximale Wiederfindung und hohe Extraktreinheit erlaubt. Unpolare Phasen (C2, C8, C18, C18 AR (Acid Resistant) und PH „Phenyl“) eignen sich für die Extraktion von Analyten aus wässrigen Matrices, wohingegen mittelpolare (CN, NH2) und polare (Si) Phasen für die Anreicherung von Arzneistoffen, z.B. aus galenischen Zubereitungen wie Salben und Ölen, vorgesehen sind. Zusätzlich gibt es neben starken und schwachen Ionenaustauschern auch so genannte Mixed-Mode-Phasen (MP1/MP3), die speziell für den Clean-up und die Anreicherung von sauren, neutralen und basischen Arzneistoffen aus Serum, Plasma und Urin entwickelt wurden (Abb. 2).

Mit der speziellen Herstellungstechnologie der SPEC-Membranen lassen sich hohe Analytretentionen und -kapazitäten erzielen. Die typische Kapazität bei unpolaren Phasen beträgt ca. 5-10% der Sorbensbettmasse. Dies bedeutet z.B. maximal 1,5 mg für eine SPEC-Phase mit 15 mg Sorbensmasse.

SPEC-Disks lassen sich wie herkömmliche SPE-Kartuschen einsetzen und betreiben - entweder manuell auf klassischen Vakuumabsaugstationen oder mit automatisch arbeitenden Liquid Handling-Systemen. 96-Well-Platten passen auf konventionelle Automationsplattformen. Da im Vergleich zur klassischen SPE die erforderlichen Lösemittelmengen für die einzelnen Arbeitsschritte deutlich reduziert sind, ist bei Vakuumabsaugstationen die Verwendung eines geringeren Vakuums ausreichend. Die Flussraten sollten bei unpolaren Phasen zwischen 1 und 5 mL/min, bei Ionenaustauschphasen < 2 mL/min betragen.

Für die Methodenentwicklung kann eine spezielle 96-well-Methodenentwicklungs-Platte verwendet werden. Von Vorteil dabei ist, dass mit einer generischen Methode bis zu acht unterschiedliche stationäre Phasen in Bezug auf Wiederfindung und Extraktreinheit untersucht werden können.

Einsatz von Mischphasen

SPEC MP1 (unpolar/SCX) eignet sich hervorragend zur Extraktion basischer Pharmawirkstoffe aus Serum und Plasma. Hier werden zwei unterschiedliche Retentionsmechanismen miteinander kombiniert, um optimale Wiederfindungsraten und maximalen Clean-up zu erhalten: Die Alkylketten der unpolaren Phase sorgen für hydrophobe, die stark sauren Benzolsulfonsäuregruppen des Kationenaustauschers für ionische Wechselwirkungen, so dass basische Wirkstoffe als Kationen an den Ionenaustauschgruppen gebunden werden (Abb. 2).

Durch effiziente Waschschritte mit Lösemitteln, wie z.B. Methanol, lassen sich lipophile saure und neutrale Störsubstanzen, die an der Alkylphase gebunden werden, aus der Matrix entfernen. Eine weitere Variante des Einsatzes von Mixed-Mode-Phasen besteht darin, sowohl saure, neutrale als auch basische Verbindungen mittels zwei verschiedener Extraktionssequenzen zu erhalten. Saure und neutrale Verbindungen werden mit einem unpolaren bis polaren Lösemittel eluiert und die geladenen basischen Analyten nach Neutralisation, z.B. mit Methanol-Ammoniak, und damit Desorption von der stationären Phase, angereichert.

Ebenso liefert die umgekehrte Vorgehensweise hervorragende Ergebnisse hinsichtlich Wiederfindung und Extraktreinheit: Es werden kationische Verunreinigungen aus der Biomatrix an den Kationenaustauschgruppen gebunden, und saure oder neutrale Analyten werden mithilfe eines lipophilen Lösemittels extrahiert.

Applikationsbeispiel

Mit einer SPEC DAU (Drugs of Abuse in Urine)-Phase lassen sich basische Drogen wie Benzodiazepine und Amphetamine aus Urin extrahieren. Die Urinprobe wird hierfür zunächst mit ß-Glucuronidase bei 56°C eine Stunde lang hydrolysiert und mit 0,1 mol/L Acetatpuffer auf pH 4 eingestellt. Zum Konditionieren der Membrankartuschen genügen 400 µL Methanol, gefolgt von 400 µL 0.1 mol/L Essigsäure. Damit ist die stationäre Phase in der Lage, sowohl unpolare als auch basische Analyten zu retenieren. Um optimale Konditionierung zu erzielen, wird ohne Vakuum gearbeitet.

Die hydrolysierte Probe (1 mL) wird anschließend unter leichtem Vakuum aufgegeben, die stationäre Phase nach dem Waschen mit 400 µL 0.1 mol/L Essigsäure und nachfolgend mit 50 µL Methanol zwei Minuten lang getrocknet. Damit werden lipophile Störsubstanzen von der stationären Phase gewaschen. Die zu bestimmenden Analyten werden mit 2 x 400 µL einer frisch bereiteten Methanol-Ammoniak (32%)-Lösung (9:1) eluiert. Ein Spezialfilter über der Disk verhindert das Verstopfen und ermöglicht, dass selbst partikelbeladene Proben ohne Filtration oder Zentrifugation extrahiert werden können.

Die Verwendung geringer Lösemittelmengen zum Eluieren führt zu hoch konzentrierten Extrakten, welche beispielsweise direkt in die LC-MS injiziert werden können. Zeitraubendes Eindampfen und erneutes Lösen des Probenrückstandes entfallen. Die Aufarbeitungszeit und der Lösemittelverbrauch werden reduziert - dies ist insbesondere bei hohem Probendurchsatz von Bedeutung. Im Vergleich zur klassischen SPE werden sowohl hohe Wiederfindungsraten als auch hochreine Extrakte erhalten. Matrixeffekte infolge von Störkomponenten werden deutlich reduziert, so dass die Ionensuppression verringert ist. Letztendlich führt dies zur Steigerung der Empfindlichkeit der Analysenmethode.

*A. Junker-Buchheit, U. Beyer, Varian Deutschland GmbH, 64289 Darmstadt

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