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Prozessentwicklung

Fed-Batch-Prozessentwicklung in geschüttelten Kulturen

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In dieser Arbeit wurde ein Vergleich von Fed-Batch-Kulturen in zwei verschiedenen Maßstäben durchgeführt, nämlich in 24-Mikroloch-Platten (3,3 mL) und in Schüttelkolben (125 mL). Sensortechnologie von Presens Precision Sensing wurde dabei eingesetzt, um sowohl den Gehalt des gelösten Sauerstoffs (DO) als auch den pH-Wert in beiden Kulturmaßstäben zu überwachen (s. Abb. 1). So sollte eine mathematische Relation zwischen Mikro- und Millilitermaßstab entwickelt werden. Diese Herangehensweise ermöglicht es auf der Basis der Daten, die in Loch-Platten ermittelt wurden, nachfolgende Experimente im Schüttelkolben und sogar im Fermenter unter vorher optimierten Bedingungen umzusetzen. Ziel ist die Reduktion der notwendigen Versuche auf ein Mindestmaß zusätzlichem Informationsgewinn. Dabei sollte die Anzahl der Versuche mit jeder Maßstabsvergrößerung sinken.

Material & Methoden

Um substratlimitierte Fed-Batch-Kultivierungen in Mikroloch-Platten und Kolben durchzuführen, wurde das Enbase-System (Biosilta) verwendet. Die Enbase-Technologie basiert auf der biokatalytischen Freisetzung von Glukose aus einem löslichen Polymer. Die Glukosezufuhr während der Kultivierung wird durch die Menge des hinzugefügten Biokatalysators bestimmt. Somit kann gänzlich auf eine mechanische Zudosierung einer Glukoselösung verzichtet werden. Ziel der hier dargestellten Experimente war es, das optimale Volumen und die ideale Konzentration des Glukose freisetzenden Biokatalysators für maximales Wachstum in Platten und Schüttelkolben zu bestimmen. Ein D-optimales experimentelles Design (DoE) mit den Faktoren Konzentration des Biokatalysators (0 bis 30 U L-1) und Volumen (0,5 bis 2,1 mL in 24-Well Platten und 7 bis 15 mL in Schüttelkolben) wurde mit der Software Modde 9.1 (Umetrics) erstellt. Als Messgröße wurde die optische Dichte bei einer Wellenlänge von 600 nm gemessen. Es wurden insgesamt jeweils elf Tests mit unterschiedlichen Volumina und Biokatalysatorkonzentrationen in den verschiedenen Maßstäben durchgeführt: 24-Loch-Platte Oxodish und Hydrodish mit dem SDR Sensordish-Reader Messsystem (Presens), sowie mit Schüttelkolben (Gesamtvolumen: 125 mL) ausgestattet mit pH und DO-Sensoren, die mit dem SFR Shake-Flask Reader (Presens) ausgelesen wurden. Die Sensordish-Lochplatten wurden mit speziellen Deckeln und Klammersystemen für optimalen Sauerstoffeintrag kombiniert (Enzyscreen). Zusätzlich zu den on-line Messungen von pH und DO in beiden Maßstäben wurde das Bakterienwachstum spektrophotometrisch bei einer Wellenlänge von 600 nm (OD600) bestimmt. Die Fed-Batch-Kultivierungen erfolgten mit mit E. coli BL21 Zellen in Enpresso B Medium (Biosilta). Die anfängliche optische Dichte der Kulturen lag zwischen OD600 = 0,1 und 0,3. Während der gesamten Kultivierungszeit wurde kontinuierlich der pH-Wert und der Sättigungsgrad an gelöstem Sauerstoff (DO) sowohl in den Platten als auch in den Schüttelkolben gemessen, um die Bedingungen zu evaluieren, die garantieren, dass die Kulturen in einem pH-Bereich zwischen 5 und 7,5 ohne Sauerstofflimitierung wachsen. Zudem wurden in regelmäßigen Abständen Proben für die Messung der optischen Dichte entnommen.

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