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Schnelles chirales Screening mittels SFC/LC-Switching-System

Flüssigchromatographie: Optimiert über Nacht

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Für den Demonstrationsversuch setzten die Tester sechs verschiedene chirale Trennsäulen und drei Lösungsmittel ein, um Enantiomerengemische (Racemate) der Pharmaka Omeprazol und Warfarin aufzutrennen. Eine spezielle Methodenentwicklungssoftware prüfte dann 36 verschiedene chromatographische Bedingungen in einer gemeinsamen Sequenz. Weil die automatisierte Erstellung der Probentabellen sowohl die menschlichen Fehler verringert als auch nötige Spülschritte für die Säulen automatisch einfügt, lassen sich so die Trennbedingungen in einer einzigen Über-Nacht-Sequenz optimieren.

Abbildung 2: Chromatogramme des Scoutings für die Omeprazol-Enantiomere
Abbildung 2: Chromatogramme des Scoutings für die Omeprazol-Enantiomere
(Bild: Shimadzu)

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In Abbildung 2 sind die entsprechenden Chromatogramme aus dem Methoden-Screening dargestellt. Um eine möglichst große Vergleichbarkeit zu erzeugen, wurden die verwendeten LC- und SFC-Methoden weitestgehend angeglichen. Durch die deutlich bessere Diffusionsfähigkeit des Kohlendioxids ergeben sich zwar leicht unterschiedliche Flussraten und Säulendimensionen. Dennoch zeigt sich der starke Einfluss von Lösungsmitteln und stationären Phasen auf die Trennungen und vor allem auch die unterschiedlichen Selektivitäten der beiden Trenntechniken HPLC und SFC.

SFC ist nicht für alle chiralen Moleküle ideal

Im vorliegenden Beispiel sind die besten analytischen Bedingungen durch einen einfachen grafischen Vergleich zu erkennen. Bei komplexeren Proben kann eine Beurteilung nach statistischen Faktoren erfolgen, z.B. nach der Anzahl der aufgetrennten Peaks. Somit kann auch bei einer großen Anzahl von Analyten schnell und sicher die beste Analysemethode festgelegt werden.

Abbildung 3: Optimierte Bedingungen aus dem Screening. Für Omeprazol (a) war eine HPLC-Trennung am effektivsten, für Warfarin (b) eine SFC-Trennung.
Abbildung 3: Optimierte Bedingungen aus dem Screening. Für Omeprazol (a) war eine HPLC-Trennung am effektivsten, für Warfarin (b) eine SFC-Trennung.
(Bild: Shimadzu)

Grundsätzlich sind SFC-Bedingungen besonders gut für die Trennung von Enantiomerengemischen geeignet. Aber die Wahl der bestmöglichen Kombination aus Säule und Lösungsmittel lässt sich nicht leicht vorhersagen, gerade bei so komplexen Trennaufgaben wie chiralen Verbindungen. In dem oben beschriebenen Beispiel mit den zwei pharmazeutisch aktiven Wirkstoffen wird genau das deutlich: Während für Warfarin die SFC die Trenntechnik der Wahl war, konnte für Omeprazol die beste Trennung unter HPLC-Bedingungen erhalten werden (vgl. Abb. 3). Dies unterstreicht den Vorteil eines gemeinsamen Systems für HPLC- und SFC-Trennung in einem Gerät: Durch die Verfügbarkeit beider Trennmethoden ergibt sich eine größere Vielfalt an zugänglichen Analyten.

Fazit – das Beste aus zwei Welten

Chirale Trennungen von Biomolekülen stellen Analytiker bei der Methodenentwicklung oft vor eine große Herausforderung. Mit den kommerziell erhältlichen SFC-Geräten der aktuellen Generation steht für diese schwierigen Trennungen ein weiterer Trennmodus zur Verfügung, der die vorhandenen Anwendungen im Labor sinnvoll ergänzen kann.

Durch die Kombination von HPLC und SFC in einem gemeinsamen automatisierten Switching-System sind die Vorteile beider Trenntechniken nutzbar. Zudem kann ein großer Grad an Automatisierung erzielt werden. So können Probentabellen für verschiedene Säulen-Lösungsmittel-Kombinationen automatisch erstellt und an das System weitergegeben werden; die Proben lassen sich unbeaufsichtigt unter LC- wie auch SFC-Bedingungen testen.

Die erhaltenen Ergebnisse können grafisch oder automatisiert bewertet werden, um die optimalen Trennbedingungen zu finden. Dabei zeigt sich, dass die SFC für einige Verbindungen überragende Trenneigenschaften aufweist, für andere aber die HPLC weiterhin das Maß der Dinge bleibt. Ein SFC/LC-Switching-System kombiniert somit die Stärken der beiden Trennmodi in einem System und verbindet das Beste zweier Welten.

* Dr. I. Spenner, Shimadzu Deutschland GmbH, 47269 Duisburg

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