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Probenvorbereitung in der HPLC

Fraktionspooling, Verdampfung & Neuformatierung in der HPLC automatisieren

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„Antihaft-Beschichtung“ vs. Verhindern der Abscheidung

Es wurden unterschiedliche Lösungen für dieses Problem in Betracht gezogen und bewertet, die in zwei grundsätzliche Kategorien fallen: die Flasche „haftfrei“ zu machen oder zu verhindern, dass sich die Probe überhaupt erst abscheidet.

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Eine „haftfreie“ Lösung, die in Betracht gezogen wurde, bestand darin, die freien Silanolgruppen in den Glasmolekülen zu terminieren, meist mit einem Silan. Es wurden mehrere kommerziell erhältliche Behandlungen geprüft. Jedoch zeigte sich keine dieser Beschichtungen als erfolgreich. Die Proben schieden sich immer noch ab und hafteten immer noch an der Flaschenseite. Mit der Silanbehandlung wurde zwar erreicht, dass sich die ganze Probe näher am Flaschenhals befand, aber dies wurde nicht als ausreichend erachtet. Darüber hinaus war keine Behandlung dauerhaft, da sie mit dem Auswaschen der Flasche im Laufe der Zeit entfernt wurde. Die Flaschen wurden darüber hinaus auch mit einem Teflon-artigen Material beschichtet. Jedoch ergab sich für die Bereitsteller dieses Materials die Schwierigkeit, dafür zur sorgen, dass die Beschichtung am Glas haften blieb, und es bestand das Risiko des Abblätterns. Diese Lösung wurde also verworfen.

Die vielversprechendste Lösung bestand darin, zu verhindern, dass sich die Lösung überhaupt erst abschied. Es wurde ein Lösungsmittel beigegeben, welches dafür sorgt, dass die Probe gelöst bleibt. Ein derartiges Lösungsmittel erfordert einen ähnlichen Siedepunkt wie Wasser, damit es nicht mit dem Acetonitril verdampft. Es wurden zwei Lösungsmittel in Betracht gezogen, Toluol und 1,4-Dioxan. Erste Testreihen mit Toluol schlugen fehl, weil Toluol nicht mit Wasser mischbar ist. 1,4-Dioxan hingegen war viel erfolgreicher.

Experimente mit Zusatzlösungsmitteln

Es wurden eine Reihe von Experimenten mit dem Rocket-Evaporation-System und dem Sample-Genie durchgeführt. In dieser Studie wurden drei Standardverbindungen verwendet. Jede davon wurde für einen unterschiedlichen Lösungsmittelbereich ausgewählt, basierend auf der Löslichkeit und darauf hin, wo sie sich am wahrscheinlichsten in einer gradierenden Umkehrphasen-HPLC herauslösen würden.

Diese Versuchsreihen wurden mit zwei Fraktionsvolumen, 100 ml und 200 ml, durchgeführt, wobei jeweils 100 mg und 200 mg der Standardverbindungen verwendet wurden. Für alle Experimente wurde die HPLC-Fraktionsmethode bei 40 °C verwendet. Die Ausbeutegrade, die in der Ampulle gesammelt wurden, lagen bei 97 bis 100% (s. Tabelle 2).

Die Menge des benötigten 1,4-Dioxan hängt vom Volumen in der Ampulle und der Wassermenge in der Probe ab. Um zu bestimmen, wie viel 1,4-Dioxan erforderlich ist, sollte zuerst die Probe mit der geringsten Menge Acetonitril und anschließend je nach Volumen die entsprechende Menge 1,4-Dioxan aus der Nachschlagetabelle (s. Tabelle 3) gewählt werden. Obwohl 1,4-Dioxan (SP 101°C) einen ähnlichen Siedepunkt wie Wasser aufweist, wird es aufgrund der niedrigen Verdampfungswärme schneller verdampfen. Bei hydrophobischen Verbindungen muss also vorsichtiger vorgegangen werden, um ein Haften an der Flasche zu verhindern.

* Dr. I. Abeysena, R. Darrington: Genevac Ltd, IP1 5AP Ipswich, Großbritannien

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