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Probenvorbereitung in der HPLC

Fraktionspooling, Verdampfung & Neuformatierung in der HPLC automatisieren

| Autor / Redakteur: Induka Abeysena und Rob Darrington* / Dr. Ilka Ottleben

Abb. 1B: Das Rocket Evaporation System
Abb. 1B: Das Rocket Evaporation System (Bild: Genevac)

Eine neue, praktische Methode erlaubt die einfache Automatisierung von Umkehrphasen-HPLC-Fraktionspooling, Verdampfung und Neuformatierung. Etwaige Verluste bei den Ausbeuten, lassen sich dabei relativ einfach umgehen. Lesen Sie hier, wie.

Viele Labormitarbeiter und Wissenschaftler kennen dieses Problem: Proben aus der Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeits-Chromatographie (HPLC) werden aus der Chromatographiesäule in größeren Mengen gelöst als eine durchschnittliche Ampulle fasst. Normalerweise würden die Proben oder Fraktionen vor dem Pooling getrocknet und dann in einer geringen Menge Lösungsmittel wie Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst, in eine kleine Ampulle gegeben und dann getrocknet werden, um das DMSO zu entfernen. Doch dieser Prozess ist aufwändig und darüber hinaus fehleranfällig. Mit dem Sample-Genie-System von Genevac ist es möglich, große Mengen (bis zu 250 ml) direkt in die gewünschte Ampulle zu verdunsten.

Sample-Genie (s. Abb. 1) wurde von Genevac speziell für Wissenschaftler entwickelt, die mit kleinen Ampullen arbeiten oder ihre getrockneten Proben in ihnen aufbewahren, wobei jedoch ihre Probe zunächst in einer großen Lösungsmenge gelöst ist. Sample-Genie ist im Wesentlichen eine Glasflasche, an der eine kleinere Ampulle befestigt werden kann, wobei eine inerte Dichtung für die Integrität der Verbindung sorgt [1]. Es wurde für die Nutzung mit den Verdampfern Genevac HT und EZ-2 sowie dem neuen Rocket-Schnell-Evaporationssystem [2] entwickelt. Zu Beginn der Entwicklung traten Probleme speziell mit Umkehrphasen-HPLC-Fraktionen auf, da ein Teil der Proben am Flaschenglas haften blieb, anstelle ganz in die Ampulle überzugehen. Im folgenden werden Ursachen und Lösung dieses Problems vorgestellt.

Problem: Abscheidung von Umkehrphasen-HPLC-Proben

Daten von Anwendungsbereichen außerhalb der Umkehrphasen-HPLC zeigten ein sehr hohes Niveau an Probenausbeute. Zwei derartige Bereiche sind die Umweltanalyse [1, 4] und Stoffwechselstudien [3], bei denen Ausbeuten von über 90% und 95% berichtet wurden. Für die meisten Wissenschaftler sind diese Werte ausreichend, da bei jeder Trocknungs- und Übertragungsmethode in eine Ampulle gewisse Verluste auftreten. Verluste lassen sich durch Waschen der Flasche minimieren. Dies könnte jedoch den Effizienzgewinn beeinträchtigen, der aus der Nutzung der Sample-Genie entsteht.

Zu beachten ist, dass bei Umkehrphasen-HPLC-Fraktionen die Proben gewöhnlich in einer Mischung aus Wasser und organischem Lösungsmittel (Acetonitrile oder Methanol) gelöst werden, wohingegen die Proben in den anderen Anwendungen normalerweise in einer organischen Einzellösung (oder einer Mischung aus ähnlichen Lösungsmitteln) gelöst werden. Zudem ist die Probenkonzentration bei der Umwelt- oder Stoffwechselanalyse normalerweise gering, einige Milligramm (mg) Probe pro 100 Milliliter (ml), während eine aufbereitete Probe Konzentrationen von 10 mg/ml oder noch mehr aufweisen kann.

Bei hohen Konzentrationen scheiden sich Proben aus der Lösung ab, bevor das Volumen klein genug ist, um nur die Ampulle zu füllen. Beim Verdampfungstrocknen erfolgt die Konzentration typischerweise bis zur Trocknung, und am Sättigungspunkt der Lösung wird sich die gelöste Probe absondern und an der Flasche haften (s. Abb. 2). Hinzu kommt, dass in der Vakuum-Verdampfung das organische Lösungsmittel schneller verdampft als das Wasser in der Fraktion. Sobald das gesamte organische Lösungsmittel verdampft ist, werden sich auch nicht in Wasser lösliche, nicht-polare Moleküle abscheiden.

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