HILIC-Tipps, Teil 3 Welche stationären Phasen nutzt man für HILIC?

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Der Weg zu einer guten Trennung beginnt mit der Wahl der passenden Säule. Kein leichtes Unterfangen, gibt es doch zahlreiche Hersteller, die schier endlos viele Variationen an stationären Phasen anbieten. In diesem Tipp erklären wir die drei Grundtypen an stationären Phasen und blicken auf die zugrundeliegende Chemie der Säule.

Eine allgemeine und sinnvolle Einteilung der stationären Phasen in der HILIC basiert auf der Anwesenheit funktioneller Gruppen an der Partikeloberfläche und deren Ladungszustand. Genau genommen kann man sie aber auch in nicht-modifizierte und modifizierte Silica-Partikel einordnen sowie Letztere zusätzlich in neutrale, geladene und zwitterionisch geladene Phasen. Als Basis für funktionelle Phasen dienen neben vollporösen Silica-Partikeln seit einigen Jahren auch so genannte Core-Shell-Partikel, die noch mehr Flexibilität und Diversität in die HILIC Trennung bringen.

Die Anzahl der auf dem Markt befindlichen stationären HILIC Phasen nimmt weiterhin stetig zu, sodass die Auswahl der richtigen Säule für den jeweiligen Analyten nicht immer einfach ist. Eine generelle Beschreibung der HILIC Phasen besagt jedoch, dass typische HILIC-Phasen durch ihren hydrophilen Charakter Wasser auf der Oberfläche anreichern. Ein Blick in die Auswahl von verfügbaren HILIC Phasen zeigt aber, dass nicht alle Phasen gleich gut dafür geeignet sind.

Phasen kennen, besser trennen

Zuallererst beeinflusst die unterschiedliche Hydrophilie der Materialien die Anreicherung der Wassermoleküle sowie die folgende Dicke der Wasserschicht, in die die Analyten aus der mobilen Phase übergehen können (Partition-Mechanismus). Das hat einen direkten Einfluss auf die Retention dieser Analyten.

Zusätzlich ermöglicht die Anwesenheit polarer funktioneller und/oder geladener Gruppen auf der Materialoberfläche Wasserstoffbrückenbindungen und/oder elektrostatische Wechselwirkungen mit entsprechenden Analyten. Aus diesem Grund ist es auch wichtig, die stationäre Phase auf Basis der chemischen Eigenschaften der zu untersuchenden Analyten zu wählen. Ein hilfreicher Ansatz, um diese Auswahl treffen zu können, ist es, hinter dem jeweiligen Verkaufsnamen zunächst einmal den verwendeten Typ der stationären Phase zu erkennen.

HILIC Phasen basieren meist auf Silica- oder den neueren „Core Shell“-Partikeln. Dabei lassen sich prinzipiell zwei Gruppen unterscheiden: unverändert freiliegende Partikel mit freien Silanolgruppen oder Partikel mit polaren, funktionellen Gruppen, die kovalent an die Silanole gebundenen sind. Ein prinzipielles Schema dieser Klassifizierung ist der Abbildung 2 zu entnehmen.

Rolle des pH-Wertes bei Silicaphasen

Die frühen Anwendungen in den ersten Jahren der HILIC wurden oft mit unmodifiziert vorliegenden Silicapartikeln (Typ A und B) durchgeführt [1]. Diese gehören auch heute noch zu den populärsten (wenn auch äußerst sensibel zu handhabenden) Materialien, speziell zur Trennung von Zuckern. Silica-basierte Materialien haben Silanolgruppen auf der Oberfläche, die bei einem pH über 4 bis 5 (teilweise) deprotoniert vorliegen und deshalb auch als Kationenaustauscher fungieren. Sie halten positiv geladene, basische Analyten stark zurück. Leicht schwankende pH-Werte wirken sich hier direkt auf die Retentionseigenschaften der stationären Phase aus, oft auf Kosten der Reproduzierbarkeit.

Kennzeichnung der Phasen ist besser geworden

Lange Zeit wurden diese Phasen lediglich unter dem Begriff „HILIC“ verkauft und es war schwer zu erkennen, um welche Phase (z.B. der Silica) es sich handelte. Nicht nur die namentlich benannten Beispiele, die wir vor zehn Jahren in unseren frühen HILIC-Tipps erwähnten, sind heute meistens mit dem Vermerk „Si“ oder „Silica“ belegt, auch die anderen Arten der Phasen sind meistens mit den konkreten funktionellen Phasen im Produktnamen zu erkennen.

Wir freuen uns sehr über diese Entwicklung, denn sie hilft uns als Anwendenden sehr im Alltag. Es bleibt zu hoffen, dass alle Phasenhersteller dies nun übernehmen und ein größeres Augenmerk auf ihr Produktmarketing und den darin enthaltenen Namen der wasseranreichernden Gruppen legen.

Die drei Phasentypen im Detail

Sämtliche Säulenhersteller sowie mehrere Forschungsgruppen haben in den vergangenen zwei Dekaden viel Ehrgeiz und Arbeit in die Entwicklung neuer und maßgeschneiderter polar modifizierter Phasen gelegt. Die Phasen werden meistens durch Derivatisierung mit polaren funktionellen Gruppen der entsprechenden Oberfläche hergestellt (d.h. vollporös oder Core-Shell). Diese können dann konventionell je nach Basis des Ladungszustands der funktionellen Gruppen in neutrale, geladene oder zwitterionische Phasen eingeteilt werden. Diese Aufteilung ist in der Reihenfolge auch den Abbildungen 3a) bis 3c) zu erkennen.

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1) Neutrale Phasen

Neutrale stationäre Phasen enthalten polare funktionelle Gruppen, die im typischen HILIC-pH-Bereich von 3 bis 8 in ihrer Neutralform vorliegen. Die Retention der Analyten basiert somit überwiegend auf hydrophilen Wechselwirkungen. Viele der stationären HILIC-Phasen gehören in diese Kategorie. Diese weisen eine sehr große Variabilität von funktionellen Gruppen auf, darunter Amide, Aspartamide, Diole (z.B. Alkyl-diole oder Cross-linked Diole), Cyano- und Cyclodextrine als funktionelle Gruppen. Einige davon sind auch in Abbildung 3a) gezeigt, inklusive deren Wechselwirkungseigenschaften.

Diese Phasen eignen sich u.a. zur Trennung von Oligosacchariden, Peptiden, Proteinen und Oligonucleotiden. Cyclodextrin-Phasen werden zusätzlich auch in der chiralen HILIC-Trennung eingesetzt, allerdings empfehlen wir hierfür eher die Technik der SFC zu nutzen. Diese ist nicht nur im pharmazeutischen Bereich für sehr effiziente Trennungen mit chiralen Phasen bekannt.

2) Geladene Phasen

Elektrostatische Wechselwirkungsmöglichkeiten (s. Tipp 2 und unsere frühe Publikation [2]) sind vor allem mit geladenen Oberflächen der HILIC-Säule möglich. Eine in der HILIC häufig genutzte positiv geladene stationäre Phase ist die Amino-Phase (s. Abb. 3b).

Die funktionelle Gruppe besteht aus einem Aminopropylrest mit einer primären Aminogruppe, welche positiv geladen vorliegt und hohe Affinität für anionische sowie saure Analyten zeigt. Manchmal wechselwirken die Analyten sogar so stark mit der Phase, dass man eher Ionenaustauscher-Effekte nutzt als den Effekt der Wasserschicht. In diesem Fall basiert die Trennung der geladenen Analyten stark auf einem Anionenaustausch-Mechanismus. Aminophasen können allerdings auch sehr erfolgreich für die Trennung neutraler polarer Moleküle genutzt werden, die aufgrund der hohen Hydrophilie dieser Phasen (und somit einer stabilen Wasserschicht) stark auf der Säule zurückgehalten werden.

3) Zwitterionische Phasen

Zwitterionische stationäre HILIC-Phasen sind in verschiedenen Versionen erhältlich (s. Abb. 3c) und weisen generell die breiteste Selektivität aller HILIC–Phasen auf. Zwitterionische Gruppen enthalten sowohl eine permanente positive als auch eine permanente negative Ladung. Diese Phasen sind sehr hydrophil, beinhalten gleichzeitig aber auch moderate Ionenaustauscher-Eigenschaften. Aus diesem Grund können diese Phasen sowohl für die Trennung von neutralen, sauren, aber auch basischen Molekülen herangezogen werden als auch für anorganische Ionen. So ist die Empfehlung für die HILIC-Analyse spezieller Analyten, sich Phasen mit spezifischerer Eigenschaft zu suchen.

An dieser Stelle wollen wir auch darauf hinweisen, dass es namentlich sehr viele Varianten der zwitterionischen Phasen gibt, dass aber die Chemie dahinter (ja sogar teilweise die Zahl der Hersteller) nicht so variabel und breit ist wie es scheint. Fragen Sie besonders bei der klassischen ZIC-HILIC-Phase nach, wer die herstellende Einrichtung ist, nicht dass Sie nach dem Wechsel feststellen: anderer Name, aber exakt die gleichen Trennungseigenschaften.

Daumenregel zur Phasenwahl

Zurück zur Einteilung der Phasen aus Abbildung 3 a) bis c): Eine gute Regel, um die bestgeeignete HILIC-Phase auszuwählen, ist folgende: Berücksichtigen Sie, dass neutrale Analyten meist weniger hydrophil sind als die geladenen. Somit eignen sich Amidphasen, geladene bzw. zwitterionische Phasen entsprechend gut für die Retention neutraler Moleküle. Auf der anderen Seite sind geladene Moleküle durch deren elektrostatische Anziehungskräfte mit der entgegengesetzt geladenen Phase von HILIC-Materialien oft so stark retardiert, dass neutrale und zwitterionische Phasen ein besseres Ergebnis bringen.

Nach der Wahl der richtigen stationären Phase steht nun die Auswahl der mobilen Phase an. Somit ist das Thema des nächsten Tipps schon gesetzt.

Literatur

[1] B. Buszewski and S. Noga: Hydrophilic interaction liquid chromatography (HILIC)—a powerful separation technique. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2012, 402, 231–247.

[2] G. Greco and T. Letzel: Main interactions and influences of the chromatographic parameters in HILIC separations (pdf), Journal of Chromatographic Science, 2013, 51 (7), 684-693.

Zu den anderen HILIC-Tipps

HILIC-Tipps, Teil 1

Ein Plädoyer für HILIC – die unterschätzte Methode der LC

HILIC-Tipps, Teil 2

Retention und Elution bei HILIC vs. RPLC

Die Autoren

Dr. Thomas Letzel: Gründer und Geschäftsführer, Analytisches Forschungsinstitut für Non-Target Screening GmbH (AFIN-TS), www.afin-ts.de
Thomas Letzel wurde zum Chemielaboranten ausgebildet, studierte im Anschluss Chemie und promovierte in der Umweltanalytik. Danach erfolgten analytische Forschungsaufenthalte in Amsterdam und in München (an der TUM; wo er seit 2009 auch als Privatdozent „Analytische Chemie und Bioanalytik“ unterrichtet). Er forscht und berät seit 2018 (im Gründertrio) mit seinem eigenen Forschungsinstitut und hat es sich zur Aufgabe gemacht, HILIC als HPLC-Methode stärker in den analytischen Alltag zu holen.

Dr. Stefan Bieber: Gründer und Geschäftsführer, Analytisches Forschungsinstitut für Non-Target Screening GmbH (AFIN-TS)
Gemeinsam mit Thomas Letzel leitet Stefan Bieber die AFIN-TS GmbH als Geschäftsführer und beschäftigt sich seit vielen Jahren mit dem Non-Target Screening.

Dr. Annette Dibowski: Geschäftsführerin, Dichrom GmbH, www.dichrom.com
Annette Dibowski ist nicht nur Geschäftsführerin von Dichrom und Sales Consultant bei Biotech Fluidics, sondern auch leidenschaftliche „Polarforscherin“ in der Chromatographie polarer Verbindungen.

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