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Größenbestimmung

Größe von Proteinen und Makromolekülen mit GPC/SEC bestimmen

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Es gibt zwei Parameter, die häufig zur Definition der Größenangabe verwendet werden: der Trägheitsradius Rg (engl. radius of gyration) und der hydrodynamische Radius RH. Einfach dargestellt, ist der Trägheitsradius eine mathematisch definierte Größe, welche die Verteilung der Massepunkte im Molekül beschreibt. Im Gegensatz dazu ist der Trägheitsradius eine phänomenologische Eigenschaft des Moleküls. In der Praxis heißt dies, dass der hydrodynamische Radius, da er etwas über die Verhaltenweise des Moleküls aussagt, insbesondere für biologisch wichtige Moleküle die nützlichere Größe darstellt.

Bestimmung des Trägheitsradius durch Viskositätsmessungen

Die direkte Messung des Trägheitsradius ist nur durch die Messung der Streulichtintensität über dem Beobachtungswinkel möglich. Die Untergrenze für alle Detektoren, selbst unter idealen Bedingungen, beträgt 12 bis 15 nm. Das heißt, dass für fast alle Proteine und viele Kondensationspolymere der Trägheitsradius so nicht gemessen werden kann. Am oberen Ende der Größenskala besteht hingegen die Problematik, dass man nicht-lineare Daten anfittet. Für viele große Moleküle wie beispielsweise Polysaccharide erhält man daher mit winkelabhängigen Detektoren fehlerbehaftete Ergebnisse, sowohl bezüglich des Molekulargewichts als auch der Größe.

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Eine gute Einschätzung des Trägheitsradius erhält man hingegen aus Viskositätsmessungen. Die Flory-Fox-Gleichung beschreibt den Zusammenhang zwischen Molekulargewicht, intrinsischer Viskosität [η] und dem Trägheitsradius:

M [η] = 63/2Φ0R3g

Hydrodynamischen Radius mit Dreifachdetektion messen

Der hydrodynamische Radius kann auf zwei Arten bestimmt werden: Die erste Methode ist die dynamische Lichtstreuung. Diese Technik wird häufig im Batch-Verfahren eingesetzt, um die durchschnittliche Größe der gesamten Probe zu bestimmen. Eine sehr akkurate, präzise und insbesondere praktikable Methode zur Bestimmung des hydrodynamischen Radius aller Komponenten einer Probe ist die SEC mit Dreifachdetektion (engl. Triple Detection). Durch den Einsatz von Online-Lichtstreu-, Brechungsindex- und Viskositätsdetektion ist es direkt möglich, das Molekulargewicht und die intrinsische Viskosität der Probe an jedem Punkt des Chromatogramms genau zu bestimmen.

Dies erlaubt dann die einfache Bestimmung des hydrodynamischen Radius an jedem Punkt. Folgende Formel beschreibt den Zusammenhang zwischen Molekulargewicht, intrinsischer Viskosität und dem hydrodynamischen Radius:

M [η] = 4/3πυNAR3H

Ausstattung und Messbedingungen für die Größenbestimmung

Um die Anwendung der SEC mit Dreifachdetektion für die genaue Größenbestimmung zu demonstrieren, wurden folgende Geräte und Messbedingungen verwendet: Für die Messungen kam ein Viscotek Model 302 Triple Detector Array (TDA), ausgestattet mit Lichtstreudetektor, differenziellem Viskositäts- und Brechungsindexdetektor zum Einsatz. Zwei 30-cm-Trennsäulen (mixed bed) wurden zur Trennung der Proben verwendet. Als Laufmittel wurde Wasser mit 0,5 M LiNO3 bei einer Flussrate von 0,6 mL/min eingesetzt. Die verwendeten Proben waren Dextran T70 (Pharmacia) und Bovine Serum Albumin (Sigma). Die Probenkonzentration lag bei ca. 3 mg/mL, das Injektionsvolumen bei 100 µl. Für die Berechnung der Ergebnisse wurde die Omnisec-Software von Viscotek eingesetzt. Die Ergebnisse der Dextran-Probe sind in Abbildung 2 dargestellt, die Messwerte des BSA sind in Tabelle 1 zusammengefasst.

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