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Proteinanalyse

High-Throughput-Systeme für die labelfreie Proteinanalyse

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In Abhängigkeit der spezifischen Anwendung stehen alternative Biosensoren zur IgG-Quantifizierung zur Verfügung, darunter neben Protein A, Protein G und Protein L weitere human- und mausspezifische Modifikationen. Darüber hinaus ermöglichen mehrere Kits und Verfahren den Nachweis von Anti-Drug-Antikörpern (ADA) mit geringer Affinität, den Nachweis von Rest-HCP (Host Cell Protein) sowie den Nachweis von Rest-Protein A.

Die Quantifizierung kundenspezifischer Analyte kann erfolgen, indem der Anwender den von ihm gewählten Liganden mit einem Streptavidin-(SA)-Biosensor oder einem aminreaktiven (AR2G) Biosensor immobilisiert. Auf diese Weise lassen sich ELISA-Protokolle in effizientere BLI-Methoden zur Konzentrationsbestimmung auf einem Pall-Fortebio-System umwandeln. Die erforderlichen häufigen Waschschritte der ELISA-Methoden entfallen. Das Ergebnis wird genauer (Coefficient of Variation; CV < 10 %) und schneller erzielt. Darüber hinaus können auch nicht aufbereitete Rohproben mittels eines Pall-Fortebio-Assays analysiert werden.

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Labelfreie Kinetik-Assays

Die steigende Nachfrage nach qualitativ hochwertigen Antikörpern mit hoher Spezifität verlangt nach einer Optimierung herkömmlicher Hybridoma-Herstellungsverfahren. Diese Prozessoptimierung erfordert Screening-Verfahren, die Antikörper-Antigen-Interaktionen zu einem frühen Zeitpunkt aussagekräftiger charakterisieren. Die Verwendung des ELISA-Verfahrens als klassische Endpunkt-Technik liefert dabei nur in begrenztem Umfang die Informationen, die zur Identifizierung von Antikörpern mit hoher Bindungsaffinität beitragen. Darüber hinaus besteht das Risiko nicht erwünschter Interferenzen der Detektionsagenzien. Antikörper mit geringer Bindungsaffinität können zudem während der erforderlichen Waschschritte entfernt werden, sodass sich diese nicht mittels ELISA charakterisieren lassen.

Im Gegensatz dazu liefern labelfreie Screening-Verfahren detaillierte kinetische Informationen zur Antikörper-Antigen-Interaktion in Echtzeit, womit eine zuverlässige Bestimmung der Bindungsaffinität des Antikörpers für das jeweilige Antigen ermöglicht wird. Anders als bei ELISA-Methoden, die nur ungefähre Affinitätskonstanten (KD-Werte) liefern, ermöglichen labelfreie Screening-Verfahren die Bestimmung von Affinitätskonstanten (KD-Werte) und Assoziationsraten/Disssoziationsraten (On/Off-Raten, ka, kd). Dies ist insbesondere deshalb von Bedeutung, da unterschiedliche Assoziations- und Disssoziationsraten dieselbe Affinitätskonstante ergeben können (s. Abb. 2). Die Technologie lässt sich zudem sehr erfolgreich für das Epitope Mapping bzw. Epitope Binning aus nicht aufbereiteten oder gereinigten Proben einsetzen. Diese kompetitiven Bindungsassays identifizieren IgG-Paare, die an dieselben oder überlappende Epitope eines Antigens binden (s. Abb. 3).

Zusammenfassung

Die Pall-Fortebio-Plattform nutzt mikrofluidikfreie Systeme, bei der Biosensoren direkt in die Probe eintauchen und für das markerfreie parallele High-Throughput-Screening von Antikörpern in komplexen, nicht aufbereiteten Proben gegen Zielantigene eingesetzt werden. Sie reduziert die Kosten sowie den Arbeits- und Zeitaufwand im Labor, zumal die Analyse direkt im Medium oder Lysat erfolgt, ohne dass Reinigungsschritte erforderlich wären.

* Dr. H. Wünsche und Dr. D. Sievers: Pall Life Sciences, Bio-Pharmaceuticals, 63303 Dreieich

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