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Proteinanalyse

High-Throughput-Systeme für die labelfreie Proteinanalyse

| Autor / Redakteur: Hendrik Wünsche und Dirk Sievers* / Marc Platthaus

Die Biolayer-Interferometrie ist ein labelfreies Verfahren zur schnellen Echtzeit-Proteinanalyse.
Die Biolayer-Interferometrie ist ein labelfreies Verfahren zur schnellen Echtzeit-Proteinanalyse. (Bild: PMS)

Die Proteinanalyse sucht nach Technologien, die ohne Detektionsagentien auskommen. Der Einsatz mikrofluidikfreier Systeme, die eine einfachere Handhabung, schnellere Messung und deutlich umfangreichere Datensätze versprechen, finden in zunehmendem Maße Anwendung.

Die Biolayer-Interferometrie folgt dem Prinzip der optischen Interferometrie, das auf der Überlagerung von Lichtwellen basiert. Der Einsatz glasfaserbasierter BLI-Biosensoren mit spezifischen Oberflächenmodifikationen an der Spitze des Sensors macht es möglich, weißes Licht (inklusive aller Wellenlängen des sichtbaren Spektrums) durch die Glasfaser nach unten zu senden und an zwei Oberflächen einen Teil des Lichts zurück in das System zu reflektieren. Hierbei handelt es sich um die Grenzfläche zwischen der Glasfaser und einer biokompatiblen Schicht sowie die Grenzfläche zwischen der Sensorspitze (mit gegebenenfalls gebundener Probe) und der Lösung. Die Pfadlänge dieser zweiten Reflektion vergrößert sich, sobald Moleküle an die Oberfläche des Biosensors binden. Die Reflektionen entstammen derselben Lichtquelle und enthalten somit dieselben Wellenlängen im sichtbaren Spektrum.

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Eine wellenlängenspezifische Betrachtung der Überlagerung dieser beiden Reflektionen, d.h. die Auftragung der relativen Intensität in Abhängigkeit der Wellenlänge, führt zu einem spezifischen Interferenzmuster, das die Grundlage der BLI-Messungen ausmacht. Dieses Interferometrie-Profil wird infolge der Bindung von Molekülen an der Sensoroberfläche verschoben. Je mehr Moleküle an die Sensoroberfläche binden, desto stärker ist dieser Effekt. Analog lässt sich eine Verschiebung des Interferometrie-Profils in gegensätzliche Richtung beobachten, sobald Moleküle von der Oberfläche dissoziieren. Die grafische Auftragung dieser Verschiebung gegen die Zeit liefert eine klassische Assoziations-Dissoziations-Kurve, aus der sich Assoziationsraten/Dissoziationsraten (On/Off-Raten, ka, kd) sowie Affinitätskonstanten (KD) ohne Einsatz von Detektionsagentien in Echtzeit bestimmen lassen.

Fortebio-Geräte-Portfolio

Die BLI-Technologie findet seit 2005 in den Systemen von Fortebio, mittlerweile ein Unternehmen von Pall Life Sciences, eine kommerzielle Anwendung. Die Familie der Pall-Fortebio-Octet-Systeme wird für die labelfreie Analyse biomolekularer Interaktionen im 96-Well- oder 384-Well-Format eingesetzt. Sie wird seit 2012 durch das manuelle Pall-Fortebio-Blitz-System als handliche Alternative für Anwendungen mit geringem Probenaufkommen ergänzt.

Alle Systeme ermöglichen Echtzeit-Bestimmungen von Proteinen sowie Echtzeit-Messungen von Affinitäten und Kinetiken im „Drop-Read-Done”-Format und zeichnen sich durch einfache Handhabung, Schnelligkeit und Wirtschaftlichkeit aus. Die Systeme lassen sich für zahlreiche Prozessschritte in der Proteinforschung einsetzen, darunter die Analyse von Säulenfraktionen, die Durchführung von Qualitätskontrollen und die Untersuchung von Proteinexpressionen.

Ergänzendes zum Thema
 
Interview mit Dr. Julia Janzon, Head of Protein Characterization & Preformulation, Formycon AG

Die Pall-Fortebio-Plattform erlaubt dank ihres effizienten Arbeitsablaufs eine einfache und schnelle Charakterisierung neuer Arzneimittelkandidaten in den Bereichen Drug Discovery und Drug Development, wo herkömmliche zeitintensivere Verfahren im höheren Probendurchsatz eingeschränkt sind und massive Kosten produzieren.

Eine verbreitete Anwendung in der Entwicklung und Herstellung von Antikörpern ist das Screening von Hybridoma-Überständen mittels ELISA (Enzym-linked Immunosorbent Assay), Immunohistochemie oder Western Blot. So ermöglicht beispielsweise die Quantifizierung von Human-IgGs in Überständen von Einzelkolonie-Wells die Selektion der Zelllinien, die die höchsten Antikörper-Produktionsraten aufweisen. Diese Konzentrationsbestimmung, für die es bislang kein effizientes Verfahren gab, kann nun über ein schnelles zwei-minütiges Pall-Fortebio-Octet-Protokoll erfolgen, das mit spezifischen Anti-Human-Fab-CH1-Biosensoren und einer entsprechenden IgG-Standardreihe quantifiziert. Alle Human-IgG-Subtypen werden erkannt, während freie leichte IgG-Ketten oder der Human-Fc-Teil der schweren Kette nicht gebunden werden.

Die Schnellanalyse der Antikörper-Konzentration ist zudem beim Testen von Chromatographiefraktionen, Zellkulturreagenzien oder Wachstumsfaktoren ein wichtiges Kriterium. Vor Einführung der Pall-Fortebio-Plattform waren Affinitätsreinigungen der einzelnen Proben zur Bestimmung der Antikörper-Konzentration nötig.

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