DNA-Adsorption an der Röhrchenwand bei der Vorbereitung von NGS-Proben Hochsensible Assays ohne DNA-Verlust

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Für das Next Generation Sequencing von DNA-Proben sind inerte Probengefäße unerlässlich. Welche Unterschiede die Wahl des Kunststoffes der PCR-Platte auf die Analysenergebnisse hat, zeigt der folgende Vergleich von drei verschiedenen Polypropylen-Wells.

Kunststoffe haben die Life Sciences erst zu dem Forschungsfeld gemacht, das sie heute sind. Denn die vielseitigen Materialien können zu Einwegprodukten verarbeitet werden, die speziellste Anforderungen erfüllen und nahezu beliebige Gefäßformen annehmen. So ist Polypropylen (PP) der ideale Kunststoff für (q)PCR-Röhrchen, da es chemisch inert ist, beständig gegenüber Lösungsmitteln und gut geeignet für das Spritzgießen. Mit diesem Verfahren lassen sich (q)PCR-Platten mit sehr dünnen Wänden herstellen, die einen schnellen Wärmetransfer und somit optimale (q)PCR-Ergebnisse ermöglichen. Trotz der sehr hydrophoben Eigenschaft von PP kann es vorkommen, dass DNA an der Wandoberfläche bindet, insbesondere unter stark ionischen Bedingungen [1]. Verschiedene Hersteller haben deshalb extra Produkte mit geringer Bindungsneigung in ihr Sortiment aufgenommen, um das Auftreten von DNA-Adsorption zu reduzieren [2].

Eine besonders wichtige Eigenschaft von PP ist die Oberflächenladung, die sich auf die Adsorption von DNA auswirkt. Zwar ist die Bindung von DNA an PP normalerweise unkritisch für die (q)PCR, da bei der Amplifikation die gesamte an den Wänden der Wells anhaftende DNA während des Denaturierungsschritts freigesetzt und somit die Verfügbarkeit der DNA für die Reaktion aufrechterhalten wird. Dies wird allerdings aufgrund der fortschreitenden Miniaturisierung von Reaktionsvolumina und der Entwicklung neuer Technologien wie der Hochdurchsatz-Sequenzierung (Next Generation Sequencing, NGS) immer häufiger zu einem Problem. Denn diese Verfahren nutzen häufig sehr geringe Mengen an DNA und umfassen mehrere Inkubations- und Transferschritte, weshalb sie Verbrauchsmaterialien mit äußerst geringer DNA-Bindungsneigung erfordern, um die Spezifizität und Gleichförmigkeit der Reaktion sicherzustellen. Für solche hochempfindlichen Analysen wird im Folgenden ein Workflow vorgestellt, mit dem die hohen Qualitätsansprüche erfüllt werden. Dabei werden sowohl die Transferschritte betrachtet als auch die Rolle der Inkubationstemperatur.