Worldwide China

HPLC

HPLC-Gradienten optimieren

03.09.2008 | Autor / Redakteur: Silvia Marten*, Anke Knöfel* und Peter Földi* / Marc Platthaus

Der neue Eluentenmischer Smartmix kann für eine Vielzahl unterschiedlicher Trennungen – von der RP-HPLC bis zur UHPLC – eingesetzt werden.
Der neue Eluentenmischer Smartmix kann für eine Vielzahl unterschiedlicher Trennungen – von der RP-HPLC bis zur UHPLC – eingesetzt werden.

Neben der Kontrolle der Instrumentenkomponenten wie Pumpe und Detektor ist für erfolgreiche HPLC-Trennungen auch ein optimaler HPLC-Gradient erforderlich. Lesen Sie, wie HPLC-Gradientenanlagen getestet werden können und wie ein neuer Eluentenmischer optimale Bedingungen schafft.

Die Reproduzierbarkeit und Genauigkeit einer HPLC-Trennung hängt in hohem Maße von der Zusammensetzung des Eluenten bzw. jeweiligen Lösungsmittelgemisches ab – vorausgesetzt alle übrigen Systemkomponenten arbeiten einwandfrei. Dies gilt besonders für isokratisch durchgeführte Trennungen. Im Gradienten-Modus jedoch wird die Qualität einer Analyse zu jedem Zeitpunkt sowohl durch das Dosieren der Eluenten (Stichwort: Mischverhältnis) als auch durch das Durchmischen selbst beeinflusst. Aus diesem Grunde sollte in festgelegten Zeitintervallen in Routine-Labors die Förderung der Eluenten überprüft werden. Dies ist ebenso wichtig wie der Test der eingesetzten HPLC-Säulen auf ihre Effizienz [1, 2] und Selektivität [3, 4].

Um die Instrumente eines HPLC-Systems zu kontrollieren bzw. sich ihrer einwandfreien Funktion zu vergewissern, sind Stufengradienten die nützlichsten und aussagekräftigsten Tests. Sie beziehen die Überprüfung der Gradienten-Linearität in den Test mit ein. Diese Kontrollen sollten zumindest halbjährlich durchgeführt werden [5]. Es mag zwar die Überprüfung des Proportionierens und Förderns der Eluenten durch ein Fördersystem, d.h. das Testen von Proportionierventilen, Pumpen und ihrer Ansteuerung das Formen von Wasser/Wasser-, Methanol/Methanol oder ACN/ACN-Gradienten genügen. Die Leistungsfähigkeit eines Gradienten hängt jedoch nicht nur vom Proportionieren der jeweiligen Lösungsmittel ab, sondern auch sehr stark von der Güte ihrer Durchmischung selbst.

Testvorschriften für HPLC-Methoden

Dies gilt besonders für Gradienten, deren Komponenten aus Wasser und organischen Lösungsmitteln bestehen. Daher war es eine Voraussetzung, entsprechende Testvorschriften zu entwickeln, die auf alltäglich angewandten chromatographischen Verfahren und Methoden beruhen. Dies beinhaltet das Formen von Gradienten aus anorganischen und organischen Phasen, sowie aus schwachen Puffern und solchen mit sehr hoher Ionenstärke, die häufig bei biochemischen Trennungen verwendet werden. Zusätzlich liefern Testverfahren Informationen über Linearität und Streulicht speziell von UV-Detektoren.

In der Umkehrphasenchromatographie (RP-HPLC) werden sowohl für isokratische Trennung als auch bei Gradientenelution Wasser und Acetonitril oder Methanol als Eluenten verwendet. Hingegen kommen für biochemische Applikationen (Ionenaustausch- (IEC), Hydrophobic-Interaction- (HIC) oder Affinitätschromatographie) wässrige Puffer zum Einsatz. Diese werden zusätzlich mit ein oder zwei Mol Salz versetzt. Durch den Einsatz des neu entwickelten integrierten statischen Mischers Smartmix kann für diese Trennungen die Qualität und Leistungsfähigkeit der Lösungsmittelgradienten beurteilt werden.

Experimente im Niederdruck- oder Hochdruck-Modus durchführen

Sämtliche Experimente wurden mit dem neuen Smartmix-Mischer und einem Smartline-HPLC-System bestehend aus ein oder zwei Pumpen 1000 und Manager 5000 von Knauer durchgeführt. Die UV-Detektoren 2500 und 2600 von Knauer waren mit einer Nano-Flusszelle von 245 nL bzw. einer analytischen von 10 µL Volumen ausgestattet. Außerdem wurde noch ein Monitor UV 9000 von GE Healthcare mit einer 10 µL Flusszelle bestückt und die Salzgradienten zusätzlich mit Leitfähigkeitsmonitor pH/C-900 von GE Healthcare aufgezeichnet. Um den für das Testen der Mischkammer selbst und für das Schließen der Pumpenventile notwendigen Rückdruck (3 bis 40 MPa) zu erzielen, wurden als Restriktoren Fused-Silica-Kapillaren (360 µm OD) unterschiedlicher Längen und Innendurchmesser verwendet.

Der Lösungsmittelmischer Smartmix wurde speziell für binäre, ternäre und quarternäre Gradienten entwickelt. Er kann sowohl im Ein-Pumpen-Modus, d.h. zum Formen von niederdruckseitigen Gradienten, als auch im Zwei-Pumpen-Modus für hochdruckseitige Gradienten eingesetzt werden. Hierfür muss die Mischkammer lediglich um 180° gedreht, also kopfüber an der Pumpe montiert, sowie die Eingangs- und Ausgangskapillaren vertauscht werden (siehe Hindergrundkasten: Smartmix).

Gradientenmischer auch für Kapillar- und Nano-HPLC einsetzbar

Soll der bisher für analytische Trennungen verwendete Smartmix für Gradienten in der Kapillar- und Nano-HPLC eingesetzt werden, so muss der im Deckel des Mischers fixierte Blindstopfen entfernt und durch einen Restriktor ersetzt werden. Dies ist in der Regel eine einfache Fused-Silica-Kapillare entsprechender Dimension. Im Mischkammerdeckel befindet sich auch das aus Metallsieben und Glasfaser bestehende Inlinefilter-Sandwich. Zur Anpassung des Volumens des Mischers an die für die Kapillar-HPLC notwendigen, niedrigen Flussraten wird die analytische Kartusche (empfohlener Flussbereich 0,5 bis 2 mL/min) gegen eine Mikrokartusche (empfohlener Flussbereich 1 bis 500 µL/min) ausgetauscht. Eine HPLC-Gradientenanlage sollte regelmäßig, mindestens im halbjährlichen Turnus nach folgenden Kriterien überprüft werden:

  • Das Fördersystem sollte überprüft werden, um nicht schließende Pumpenventile und Leckagen zu identifizieren.
  • Die Qualität des geformten Gradienten, d.h. die elektronische Ansteuerung von Pumpen und Proportionierventil, muss getestet werden.
  • Für biochemische Applikationen sollten Ionenstärke (Leitfähigkeit) und pH-Wert der als Eluenten verwendeten Puffer überwacht werden.
  • Die Linearität eines Monitors sowie der Einfluss von Streulicht auf die Detektion sollte kontrolliert werden.

Linearer Gradient und Stufengradient stellen bei unterschiedlichen Flussraten neben der völligen Durchmischung der beiden Eluenten vor allem das gute Funktionieren der Pumpe und der Proportionierventile bei der Ausbildung eines Niederdruckgradienten unter Beweis (s. Abb. 2). Gradienten mit Stufen von mehr als zehn Minuten Länge dienen speziell der Überprüfung der Zuverlässigkeit der jeweiligen Lösungsmittelzusammensetzung für das Ausarbeiten isokratischer Analysenbedingungen. Ferner dienen sie der Überprüfung der Linearität des verwendeten Detektors.

Für das Mischen von Gradienten aus wässrigen Lösungen (Eluent A) und organischen Lösungsmitteln (Eluent B) wird Benzylalkohol (0,025 Volumenprozent) als Farbzusatz (Tracer) empfohlen [6], da der Absorptionskoeffizient gewöhnlich verwendeter Substanzen (z.B. Aceton) von der Zusammensetzung des Lösemittels, in dem sie gelöst sind, abhängig ist. Sowohl für Trennungen der konventionellen, analytischen als auch der Narrowbore-HPLC können mit einem einzigen, gut funktionierenden System Gradienten hoher Qualität gebildet werden (s. Abb. 2). Dies gilt auch für Gradienten in der Nano- bzw. Kapillar-HPLC, die durch Splitten der Eluenten geformt werden.

Besonders bei analytischen Anwendungen (mit einem Flussbereich von 0,5 bis 2,0 mL/min) ist es jedoch vielfach eine Sache der persönlichen Einstellung des Anwenders, ob ein hochdruckseitig mit zwei Pumpen geformter Gradient oder ein niederdruckseitig mit einer Pumpe und Proportionierventilen gebildeter Gradient eingesetzt wird.

Biochemische Analyse mit der RP-HPLC

Auf dem weiten Gebiet biochemischer Analysen werden viele wichtige Applikationen wie die Aminosäurenanalyse [7, 8], die enzymatische Spaltung von Proteinen [9] oder die Ermittlung ihrer Sequenz [10, 11] unter anderem durch RP-HPLC durchgeführt.

Hierfür werden die Gradienten gewöhnlich durch Mischen wässriger Eluenten, wie Puffer mit organischen Lösungsmitteln (z.B. Acetonitril oder Methanol), gebildet. Für die Trennung nativer Biopolymere jedoch werden meistens andere chromatographische Trennverfahren wie Ionenaustausch-, Hydrophobic-Interaction- oder Affinitätschromatographie angewandt. Dies bedeutet, dass als Eluenten Puffer niedriger Ionenstärke mit Puffern hoher Ionenstärke bzw. hoher Salzkonzentrationen gemischt werden müssen [12, 13, 14]. Für diese Applikationen muss der Tracer Benzylalkohol durch Aceton oder Uracil ersetzt werden. Dies liegt an seiner geringen Löslichkeit in salzhaltigen Lösungen. Das Überprüfen von Salzgradienten bietet einen zusätzlichen Sicherheitsgewinn, speziell wenn dieser nicht nur über die UV-Absorption des zugesetzten Tracers, sondern auch über die Leitfähigkeit und/oder den pH-Wert des Eluenten kontrolliert wird. So ist auch eine Überwachung der Linearität der Detektoren und der Einfluss von Streulicht bei der Analyse möglich (s. Abb. 3).

Hohe Salzkonzentrationen bei HI-Chromatographie nötig

Für die Hydrophobic-Interaction-Chromatographie (HIC) – einem der effizientesten Trennverfahren zur Isolierung und Reinigung von Proteinen – werden oft Puffer mit sehr hoher Salzkonzentration benötigt. So wird die Trennung häufig mit einer Konzentration von zwei Mol Ammoniumsulfat in Puffer A begonnen. Während des Gradienten kann dann die abnehmende Ammoniumsulfatkonzentration leicht durch die Leitfähigkeit überwacht werden, wohingegen der zunehmende Gehalt von Puffer B (mit Aceton versetzt) durch dessen UV-Absorption bei 265 nm detektiert wird (s. Abb. 4).

Um eine hohe Ausbeute biologisch aktiver Proteine zu erhalten, ist es aber unbedingt erforderlich, während einer solchen Trennung auch den pH-Wert des Eluats zu kon-trollieren. Hierfür kann es notwendig sein, über einen binären Puffer-Salz-Gradienten einen zusätzlichen pH-Gradienten zu legen, was der Ausbildung eines quarternären Gradienten entspicht.

Testdiagramme von realistischen Gradienten

Selbstverständlich werden besonders zur Charakterisierung eines Proteins nach seiner Reinigung für Sequenz- und Aminosäureanalyse reproduzierbare Gradienten von hoher Qualität benötigt (s. Abb. 5). Gradienten, die aus nur wässrigen oder nur organischen Eluenten geformt sind, genügen oft nicht den Ansprüchen einer alltagstauglichen Testvorschrift. Deshalb wurden für die Überprüfung des neuen Mischers Smartmix Testdiagramme von realistischen Gradienten erstellt, wie sie täglich in wissenschaftlichen Laboratorien zum Einsatz kommen.

Bei allen durchgeführten Experimenten hat sich der Smartmix von Knauer durch seine einfache Handhabung ausgezeichnet. Er mischt effizient sowohl rein wässrige Eluenten als auch wässrige mit organischen Eluenten. In der Zukunft sollen weitere Einsatzgebiete des Mischers durch Experimente zur Nachsäulenderivatisierung von nicht chromophoren Molekülen und deren anschließender Analyse erschlossen werden.

Literatur

[1] P.A. Bristow, J.H. Knox, Chromatographia, 10, 279-288 (1977)

[2] V.R. Meyer, Practical High Performance Liquid Chromatography, John Wileys & Sons, 3rd ed., Chichester UK, 120-135 (1999)

[3] N. Tanaka et al., J. Chromat. Sci. 27, 721 ff. (1991)

[4] H. Engelhardt, M. Arangio, T. Lobert, LC-GC 15 9, 856-866 (1997)

[5] J.J. Gilroy, J.W. Dolan, LC-GC Europe, 19 9, 454-458 (2006)

[6] K. Shoikhet, H. Engelhardt, Chromatographia, 38 7/8, 421-430 (1994)

[7] S.A. Cohen, D.P. Michaud, Anal. Biochem., 211, 279-287 (1993)

[8] J. Naidanow, L. Minarikova, G. Barka, P. Foeldi, LaborPraxis 6, 56-59 (2005)

[9] E. Sterchi, W. Stöcker (eds.) Proteolytic Enzymes: Tools and Targets, Springer, Heidelberg D, (1999)

[10] C. Stuhlfelder, F. Lottspeich, M.J. Müller, European J. of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, 53, 107-113 (2002)

[11] F. Lottspeich, J.W. Engels (eds.), Bioanalytik, Spektrum Akademischer Verlag Heidelberg D, 311-328, (2006)

[12] R.K. Scopes (ed.), Protein Purification, Springer, Heidelberg D, (1994)

[13] S. Hjertén, K. Yao, K.O. Eriksson, B. Johansson, J. Chromatogr., 359, 99-109 (1986)

[14] Lottspeich, J.W. Engels (eds.), Bioanalytik, Spektrum Akademischer Verlag Heidelberg D, 227-228, (2006)

*S. Marten, A. Knöfel und Prof. Dr. P. Földi, Wissenschaftlicher Gerätebau Dr. Ing. Herbert Knauer GmbH, 14163 Berlin

 

Neue HPLC-Mischkammer mit vielfältigen Funktionen

Kommentare werden geladen....

Kommentar zu diesem Artikel abgeben
  1. Avatar
    Avatar
    Bearbeitet von am
    Bearbeitet von am
    1. Avatar
      Avatar
      Bearbeitet von am
      Bearbeitet von am

Kommentare werden geladen....

Kommentar melden

Melden Sie diesen Kommentar, wenn dieser nicht den Richtlinien entspricht.

Kommentar Freigeben

Der untenstehende Text wird an den Kommentator gesendet, falls dieser eine Email-hinterlegt hat.

Freigabe entfernen

Der untenstehende Text wird an den Kommentator gesendet, falls dieser eine Email-hinterlegt hat.

copyright

Dieser Beitrag ist urheberrechtlich geschützt. Sie wollen ihn für Ihre Zwecke verwenden? Infos finden Sie unter www.mycontentfactory.de (ID: 256061 / Meldungarchiv)