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HPLC HPLC-Methodenentwicklung zur schnellen Bestimmung von Isoflavonen

Autor / Redakteur: Noriko Shoji*, Masako Moriyama*, Naohiro Kuriyama* und Friederike Becker** / Dipl.-Chem. Marc Platthaus

Soja ist die weltweit wichtigste Quelle für Pflanzenöl und leistet aufgrund vieler sekundärer Pflanzeninhaltsstoffe einen Beitrag für eine gesunde Ernährung. In den Bohnen sind z.B. Isoflavone enthalten, die sich positiv auf den Hormonhaushalt auswirken, allerdings auch unerwünschte Nebeneffekte zeigen können. Die hier vorgestellte Methodenentwicklung einer schnellen und robusten HPLC-Analyse von Isoflavonen kann die Erforschung und Routine-analyse von Nahrungsinhaltsstoffen erleichtern.

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Beschwerden in den Wechseljahren werden häufig mit Phytoöstrogenen behandelt. Die Pflanzenhormone dienen der Vorbeugung und Abschwächung von Hitzewellen, als Prävention von Osteo-porose und Arteriosklerose sowie der Senkung des Krebsrisikos. Eine wichtige natürliche Quelle dieser sekundären Pflanzenstoffe stellt die Sojabohne dar. Epidemiologische Studien legen nahe, dass Japanerinnen und Chinesinnen aufgrund des häufigeren Verzehrs von Soja viel seltener unter den Begleiterscheinungen der Wechseljahre leiden. In der Sojabohne sind es die Isoflavone, die durch ihre östrogenähnliche Wirkung die beschwerdereiche Hormonumstellung in den Wechseljahren positiv beeinflussen können.

Neben den positiven Aspekten zeigen aktuelle Untersuchungen aber auch unerwünschte Nebeneffekte. Besonders Frauen, die ein höheres Risiko besitzen an Brustkrebs zu erkranken oder schon erkrankt sind, sollten auf die Einnahme von Phytoöstrogenen verzichten. Zudem sollte für Kinder eine gesundheitsfördernde Tagesdosis erarbeitet werden. Daher ist es erforderlich, zur Gehaltsbestimmung von Isoflavonen eine routinetaugliche und schnelle Analysenmethode zu entwickeln. Besonders geeignet sind chromatographische Methoden unter herkömmlichen RP-HPLC- und ultra-schnellen LC-Bedingungen, die eine effektive Trennung der Analyten ermöglichen. Sojabohnen enthalten neun glykosidische und drei aglykosidische Isoflavone (s. Abb. 2). Die Analyse der strukturell sehr ähnlichen polaren Substanzen ist nicht immer einfach, da die Selektivität von herkömmlichen C18-Phasen keine hinreichend guten Ergebnisse liefert [1].

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HPLC-Methodenentwicklung

Zur Methodenentwicklung wurde das hydrophile Säulenmaterial YMC Hydro-sphere C18 ausgewählt, das sich durch ein hydrophiles Endcapping auszeichnet. Die hydrophile Modifikation soll eine chromatographische Analyse von fast identischen polaren Strukturen ermöglichen. Für die konventionelle HPLC wurde ein Shimadzu LC-VP-System mit 5 µm oder 3 µm YMC Hydrosphere C18 gepackten Säulen (4,6 mm ID) eingesetzt. Die ultra-schnelle HPLC mit 2 µm YMC UltraHT Hydrosphere C18 wurde auf einem Jasco X-LC-System ausgeführt. Für die Extraktion der Isoflavone aus fester Matrix wurden die Proben mit einer Ethanol/Wasser-Mischung (50:50) versetzt und für eine Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Nach der Filtration mit Filterpapier (Nr. 5A) wurden die Proben mit einem 0,2-µm-Filter für die HPLC vorbereitet. Es zeigte sich, dass mit einem Acetonitril-Wasser-Gradienten mit Essigsäure alle Komponenten gut getrennt werden können (s. Abb. 3, Chromatogramm a). Durch weitere Variationen der Säurekonzentration konnte die Trennung optimiert werden. Das Peak-Paar 10 und 11 (Glycitein und 6“-O-Acetylgenistin) zeigte mit hoher Säurekonzentration eine Basislinientrennung, allerdings verschlechterte sich die Trennung des Peak-Paares 7 und 8 (6“-O-Acetylglycitin und 6“-O-Malonylgenistin). Mit einer mittleren Säurekonzentration von drei Prozent werden alle Komponenten fast basisliniengetrennt (s. Abb. 3, Chromatgramm c). Die Methode wurde auf dem YMC-Säulenmaterial Hydrosphere C18 (5 µm) mit einer Säulendimension von 150 x 4,6 mm ID entwickelt.

Durch den Einsatz von 3-µm-Partikeln und Anpassung der Säulendimension (Durchmesser und/oder Säulenlänge) kann die Analysenzeit erheblich verringert werden. Dabei ist zu beachten, dass das Gradientenvolumen konstant bleibt.

In Abbildung 4a und 4b wird der Methodentransfer auf einer 50 x 4,6 mm ID Säule gezeigt. Die Flussänderung von 1,0 ml/min auf 1,5 ml/min ermöglicht die gleichbleibende Auflösung ohne Änderung des Elutionsprofils.

Eine Änderung des Gradientenverlaufs kann die Auflösung sogar verbessern (s. Abb. 4b und 4c). Das kritische Peak-Paar 10 und 11 ist nun basisliniengetrennt. Diese konventionelle HPLC-Methode kann durch den Einsatz von 2-µm-Partikeln für die ultra-schnelle LC angepasst werden (Abb. 4c und 4d). Dabei wurden die chromatographischen Bedingungen an die geänderten Säulendimensionen angepasst. Abschließend wurde der Fluss erhöht, um die Analysenzeit weiter zu verkürzen (s. Abb. 4e).

Ultraschnelle HPLC-Analytik

Ziel der vorliegenden Untersuchung war die Bestimmung von Isoflavon-Gehalten in unterschiedlichen sojahaltigen Lebensmitteln. Der einfache Methodentransfer von einem klassischen Chromatographiesystem auf ein System für die ultra-schnelle HPLC (Jasco X-LC) gelang unter anderem durch den Einsatz der neuen YMC UltraHT Hydrosphere C18, einem Phasenmaterial, das auch mit einer Partikelgröße von 2 µm erhältlich ist. Bei der Analyse von Isoflavon-Gehalten in Lebensmitteln wurden z.B. Sojabohnen und Tofu, die natürliche Quellen zur Phytoöstrogen-Versorgung darstellen, untersucht. Abbildung 5 zeigt, dass sich die HPLC-Methode sehr gut zur Gehaltsbestimmung von Realproben eignet. Die Methode ist nicht nur in der konventionellen HPLC einsetzbar, sondern durch die Verwendung von 2-µm-Partikeln auch für die ultra-schnelle Analytik geeignet. Der Einsatz kleiner Partikel ermöglicht zudem eine Beschleunigung der Analysenzeiten.

Literatur

[1] N. Shoji, M. Moriyama, N. Kuriyama: Ultra-fast LC analysis of soy isoflavones in food and dietary supplements using newly developed 2 µm RP-column designed for polar compounds, HPLC 2007: 31. International Symposium on High Performance Liquid Phase Separations and Related Techniques.

*N. Shoji, M. Moriyama, Dr. N. Kuriyama, YMC Co. Ltd. Kyoto 600-8106, Japan**Dr. F. Becker, YMC Europe GmbH, 46539 Dinslaken

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