SPECIAL PROBENVORBEREITUNG Infrarot-Bioanalytik - Probenformen von Proteinen

In der Strukturbiologie hatm man sich mittlerweile an die anschaulichen und eindrucksvollen Strukturbilder von Proteinen gewöhnt, die eine wichtige Grundlage zum Verständnis der Funktion und zur Aufklärung von Reaktionsmechanismen darstellen. Die präzisen Fragen, die mit ihrer Hilfe gestellt werden können, lassen sich häufig nur mit spektroskopischen Methoden beantworten, die eine "starre" Struktur mit Informationen über Reaktivität, Funktion und Dynamik ergänzen.

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In der Strukturbiologie hatm man sich mittlerweile an die anschaulichen und eindrucksvollen Strukturbilder von Proteinen gewöhnt, die eine wichtige Grundlage zum Verständnis der Funktion und zur Aufklärung von Reaktionsmechanismen darstellen. Die präzisen Fragen, die mit ihrer Hilfe gestellt werden können, lassen sich häufig nur mit spektroskopischen Methoden beantworten, die eine "starre" Struktur mit Informationen über Reaktivität, Funktion und Dynamik ergänzen.

Eine wichtige Informationsquelle für die Proteinstruktur ist die Infrarotspektroskopie. Kaum eine andere spektroskopische Technik hat es in den letzten 25 Jahren geschafft, sich in ähnlicher Weise zur Aufklärung von Struktur, Funktion und Dynamik von Proteinen und Enzymen zu etablieren. Diese Forschritte liegen teils an der Verbreitung der Fourier-Transform IR-Spektroskopie, teils an der Entwicklung geeigneter Verfahren bei der Probenpräparation und bei der Spektrenauswertung und -interpretation.

IR-SpektroskopieVon den vielfältigen Anwendungen in der Bioanalytik sollen hier drei kurz vorgestellt werden. Bei der Analyse der Sekundärstruktur von Proteinen (Abb. 1a) werden IR-Spektren im Bereich der Amid-I Absorption (ca. 1700 cm-1 bis 1600 cm-1) mit hoher Genauigkeit aufgenommen. Nach Abzug der Absorption eines Pufferspektrums werden auflösungserhöhende Verfahren angewandt (z.B. Fourier-Selbstentfaltung, "supersmoothing" oder andere) oder Derivativspektren aufgenommen, um die Position der Bandenkomponenten zu bestimmen. Danach können die Anteile der Sekundärstrukturkomponenten mit Absorptionsmaxima, Amplituden und ggf. Halbwertsbreiten angepasst werden.

Eine Zuordnung der Komponenten erfolgt mit Hilfe von Referenzproteinen, idealerweise mit ähnlichen Sekundärstrukturanteilen. Hierin liegt auch eine grundsätzliche Problematik dieser Methode: Bei gänzlich unbekannten Sekundärstrukturen müssen Datensätze als Referenz verwendet werden, die eine breite Vielfalt von unterschiedlichen Sekundärstrukturmerkmalen beinhalten. Liegen jedoch Spektren analoger Proteine vor, so kann ein direkter Vergleich erfolgen. Am besten funktioniert diese Methode beim Vergleich von Proteinchargen, z.B. der Analyse von exprimierten Proteinen oder mutierten Proteinen, wenn ein "gold standard" da ist. Bei der Analyse von Proteinstabilität und Faltungsverhalten (Abb. 1b) werden Spektren im Amid-IBereich in Gegenwart denaturierender Reagentien oder in Abhängigkeit von der Temperatur aufgenommen (Temperaturexkursionsspektren) Daraus können leicht Faltungs-/Entfaltungsprofile und Übergangstemperaturen bestimmt werden.

In einer speziellen Variante kann mit einem Temperatursprung schnell die Entfaltung oder Rückfaltung induziert werden. Mit zeit-aufgelösten IR-Techniken ist damit eine Analyse der Faltungsdynamik und ein Erfassen von Faltungsintermediaten möglich. Neben dem Amid-I Bereich kann für diese Fragestellungen auch der Bereich der Absorption der Tyrosin-Seitenkette, insbesondere die C=C Ringschwingung bei ca. 1515 cm-1, genutzt werden, da diese leicht zu detektieren ist. In der Differenzspektroskopie funktioneller Proteinzustände werden mit Hilfe von Störungsmethoden Spektren vom Ausgangszustand einer Reaktion, von Intermediaten und vom Endzustand aufgenommen (Abb. 1c).

Diese können mit verschiedenen Methoden auch zeitaufgelöst bis in den Millisekunden- oder sogar Nanosekundenbereich, bei Lasertechniken sogar bis in den Pikosekundenbereich erhalten werden. Die Reaktion wird dabei "hands-off" an der Probe durch Stimulation mit Licht, mit Elektronentransfer in speziellen Redoxzellen, durch die photochemisch induzierte Freisetzung von Wirkstoffmolekülen, durch Feldsprung oder auch durch Temperatursprung aufgenommen. Da bei dieser Vorgehensweise dieselbe Probe in verschiedenen Zuständen untersucht wird, können mit sehr hoher Empfindlichkeit und Zeitauflösung die Reaktionen einzelner Bindungen verfolgt werden.

Probenformen

Bei der Entwicklung solcher Verfahren seit etwa 25 Jahren musste stets ein Kompromiss zwischen dem Anspruch der biologischen Relevanz und den physikalischen Randbedingungen gefunden werden (Abb. 2). Letztere sind vor allem durch die Hintergrundabsorption des Wassers und durch die geringen Extinktionskoeffizienten der Schwingungsmoden gegeben. Selbst die intensivsten Moden von Aminosäureseitenketten, z.B. die Tyrosin C=C Ringschwingung, liegen mit einem Extinktionskoeffizienten von maximal ?700 (Mol x cm)-1 nur bei einem Bruchteil des Wertes, der typischerweise für elektronische Übergänge gefunden wird. Hinzu kommen die in der IR-Spektroskopie zum Teil problematischen Fenstermaterialien.

All dies hat zur Entwicklung von speziellen Probenformen geführt, die strukturelle und funktionelle Intaktheit zeigen und dennoch mit IR-spektroskopischen Methoden untersucht werden können. Bei Transmissionsmessungen, wenn Informationen im wichtigsten Spektralbereich von ca. 1800 cm-1 bis ca. 500 cm-1 erhalten werden sollen (also auch im Bereich der Scherschwingung des Wassers um 1650 cm-1), erfordern diese Bedingungen eine Schichtdicke von maximal 10-15 µm und eine hohe Proteinkonzentration, die im millimolaren Bereich liegen kann.

Solche Proben können bei löslichen Proteinen und bei in Detergens solubilisierten Membranproteinen leicht durch Ultrafiltration mit Mikrozellen (Centricon, Microcon) erzielt werden, im Fall von Membranfragmenten durch Sedimentation in der Ultrazentrifuge. Der Wassergehalt solcher Proben ist i.d.R. vollkommen ausreichend; problematisch ist bestenfalls die genaue Einstellung des pH-Werts, da die eigene Pufferkapazität des Proteins nahe an die des hinzugegebenen Puffers kommt und daher einen ursprünglich eingestellten pH-Wert in Richtung des isoelektrischen Punkts verschiebt. Zellen mit dieser Schichtdicke sollten praktischerweise zerlegbar sein; sie arbeiten mit dünnen Folien als Spacer oder mit entsprechend geformten Fenstern. Abbildung 3a zeigt eine solche Küvette, bei der eine in ein CaF2-Fenster eingeschliffene Vertiefung die Probe aufnimmt und ein tieferer "Graben" um diese Vertiefung zur Unterbrechung der Kapillarkräfte dient.

Solche Küvetten können aus verschiedenen IR-transparenten Materialien mit Schichtdicken zwischen ca. 5 und 50 µm hergestellt werden. Sie erlauben neben der präzisen Schichtdickeneinstellung eine gründliche Reinigung. Die benötigten Probenmengen liegen bei wenigen µL. Für die Untersuchung von redoxaktiven Proben wurde im Arbeitskreis der Autoren eine spezielle Zelle entwickelt, in der an einer transparenten Goldelektrode elek-trochemische Reaktionen induziert werden (Abb. 3b). So können definierte Redoxzustände von Proteinen eingestellt und spektroskopisch analysiert werden.Während Infrarotproben in 1H2O Schichtdicken von höchstens 10-15 µm erfordern, erlauben Proteinproben in 2H2O Schichtdicken bis zu ca. 50 µm. Aufgrund der leichteren Handhabung und der besseren Signalqualität wird diese Form bei vielen Proteinuntersuchungen gewählt. Hier sei jedoch darauf hingewiesen, dass aufgrund der pH/pD-Verschiebung und kinetischer Isotopeneffekte strukturelle und funktionelle Merkmale von Proteinen in 2H2O sehr wohl von denen in 1H2O abweichen können. Messungen in 2H2O sollten daher stets Option sein, nicht aber den Regelfall darstellen.

Neben diesen flüssigen bzw. pastösen Proben können auch hydratisierte Filme verwendet werden. Dabei werden in Detergens solubilisierte oder in Lipidvesikel rekonstituierte Proteine als Suspension auf einen IR-Träger aufgebracht und der Wasserüberschuss vorsichtig durch Überblasen mit einem Inertgas reduziert. Dabei entsteht ein konzentrierter Film, der mehr oder weniger homogen ist und ggf. durch weiteres Auftrocknen „nachgebessert“ werden kann. Solche Filme können sehr homogen auch durch "spin-coating" hergestellt werden. Alternativ können die suspendierten Proben auf das IR-transparente Fenster aufzentrifugiert werden, wenn es am Boden eines Gefäßes im Becher einer swing-out Zentrifuge montiert ist. Die Dehydratisierung, auch wenn sie vorsichtig erfolgt und Restwasser beim Protein belässt, kann sich negativ auf die Funktion des Proteins auswirken oder es ganz denaturieren. Es muss daher im Einzelfall anhand eines Aktivitätstests entschieden werden, ob diese Prozedur angewandt werden kann. Oft ist die Aktivität wieder voll herzustellen, wenn dem Film nach dem vorsichtigen Wasserentzug wieder Puffer zugesetzt wird.

Solche Filme können auch in kontrollierter Weise hydratisiert werden, wenn sie in einer Kammer über der Gasphase im Gleichgewicht mit einem Reservoir stehen. Das Reservoir wird mit einer gesättigten Salzlösung gefüllt, die für eine konstante relative Luftfeuchtigkeit sorgt. Abgesehen von der hohen Konzentration und Stabilität solcher Proben bietet diese Anordnung die Möglichkeit, an ein und derselben Probe H/D-Austausch über die Gasphase durchzuführen, indem die Salzlösung in 1H2O durch eine in 2H2O ersetzt wird.

ATR-Spektroskopie

In den letzten Jahren erfuhr eine alte IR-Probentechnik eine Wiederbelebung, die Technik der abgeschwächten Totalreflexion (ATR). Ursprünglich für die Untersuchung von wenig transparenten Stoffen wie Farben und Lacke benutzt, können mit heutigen ATR-Anordnungen auf einfache Weise lösliche oder membrangebundene Proteine untersucht werden. Bei der ATR-Spektroskopie wird der IR-Strahl durch ein Material mit hoher Brechzahl so geführt, dass er an der Grenzfläche zur Probe ein- oder mehrfach totalreflektiert wird (Abb. 4a). Der in den optisch dünneren Bereich für den Bruchteil einer Wellenlänge eindringende Strahl trägt Information über die Probe beispielsweise über das gelöste Protein. In einer Variante dieser Methode immobilisiert man das Protein beispielsweise in Lipidvesikeln, direkt an der Oberfläche des ATR-Kristalls.

Diese Schicht, die nur wenige µm Dicke aufweisen muss, kann dann durch Überspülen mit Pufferlösungen mit Wirkstoffen, Substraten, Effektormolekülen oder Inhibitoren versorgt werden (Abb. 4b). So kann die Wechselwirkung des Proteins mit diesen Stoffen direkt spektroskopisch untersucht und beurteilt werden. Eine spezielle ATR-Zelle, die für hohen Druck und schnellen Durchfluss ausgelegt ist, wurde vom Arbeitskreis des Autors für einen Sensor entwickelt, mit dem die Inhaltsstoffe von Getränken quantitativ bestimmt werden können. Diese Meßmethode lässt sich in den Analysenlabors von Getränkeherstellern, Weinproduzenten und Brauereien verwenden, wo aus den Infrarotspektren durch eine Faktoranalyse und Vergleich mit einer Datenbank mit hoher Präzision z.B. der Alkoholgehalt, das gelöste Kohlendioxid und die Extraktstoffe direkt und schnell bestimmt werden können.

Durch geeignete Probengeber, z.B. in Form einer Bypass-Leitung an einem Fermenter, kann aber auch der Prozess direkt und in Echtzeit kontrolliert werden. Spezielle Formen solcher Zellen arbeiten mit zwei Kompartimenten, die durch eine Dialysemembran getrennt sind. Dadurch kann eine Proteinschicht im Bereich des ATR-Kristalls festgehalten werden, während an der Rückseite der Membran Effektormoleküle vorbeiströmen und zum Protein diffundieren können. Im Arbeitskreis der Autoren wurde eine solche Perfusionszelle mit nur 6 µL Probenvolumen entwickelt, mit der Proteinreaktionen in Mikrovolumina verfolgt werden (Abb. 5).

Vielfältige Anwendungen

Mit den in den letzten 15-20 Jahren entwickelten Präparationstechniken für die IR-Spektroskopie stehen Methoden zur Verfügung, die eine breite Anwendung in der Bioanalytik erlauben. Die ursprünglichen Hindernisse - Proteinkonzentration und Wasser-Hintergrundabsorption - können auf verschiedenen Wegen umgangen werden. Die häufig vorgebrachten Argumente, Infrarotproben von Proteinen und Enzymen seien entweder biologisch nicht relevant oder durch die Wasserabsorption dominiert, tragen nicht mehr. Derzeit sind zunehmend Anwendungen in Biochemie, Biologie und Medizin zu sehen, bei denen die hohe Molekülspezifität der Infrarotspektroskopie, die geringen Probenmengen und die kurzen Messzeiten Vorteile gegenüber anderen Techniken darstellen. IR-spektroskopischen Methoden sollte daher in der Proteomik ein hoher Stellenwert eingeräumt werden.

*.Prof. Dr. W. Mäntele, Dipl.-Phys. O. Klein, Dipl.-Phys. E. Agic., Insitut für Biophysik, Johann Wolfgang Goethe-Universität, Frankfurt am Main, Theodor-Stern-Kai 7, Haus 74, 60590 Frankfurt/Main

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