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Synthese

Kostengünstige Bio-Kaskade für Caprolactam-Synthese

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Weiterentwicklung des Moduls 2.0 zur Caprolactam-Produktion

Modul 2.0 konnte die durch die Hydrolase gebildete 6-Hydroxyhexansäure nur ungenügend weiter umsetzen. Tests für ähnliche Umsetzungen mit analogen Substraten wie 1-Hexanol oder auch 6-Hydroxyhexansäureethylester bzw. des entsprechenden Methylesters anstatt der 6-Hydroxyhexansäure führten sehr wohl zu den entsprechenden primären Aminen mit vollständigem Umsatz.

Somit musste eine Strategie entwickelt werden, welche die Inhibierung durch die Säurefunktion von 6-Hydroxyhexansäure verhindert.

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Der Einsatz alternativer primärer Alkoholdehydrogenasen, die in der Literatur als „Spezialisten“ bezüglich dem Substrat 6-Hydroxyhexansäure bekannt sind (zwei ADHs aus Acinetobacter sp. bzw. Brevibacterium epidermitis), scheiterte an deren geringen Stabilität und der schwierigen heterologen Expression in E.coli als Wirtsorganismus.

Als Lösung dieses Problems wurde im Rahmen der hier beschriebenen Arbeit die Ringöffnung des Lactons mit Methanol oder Ethanol als Nukleophil anstelle von Wasser in der wässrigen Pufferlösung erwogen. Dies führt zur Bildung des Esters anstatt der Säure, daher würde die Säurefunktion maskiert und die Inhibierung könnte umgangen werden. Ein Enzym, das eine solche Reaktion im wässrigen Medium erlaubt, war jedoch in der Literatur nicht bekannt. Methanol bekam gegenüber Ethanol den Vorzug, weil Ethanol für die primäre Alkoholdehydrogenase selbst ein gutes Substrat darstellen würde und dies zu unerwünschten Nebenprodukten beziehungsweise Problemen im internen Cofactor-Rezyklierungssystem des Moduls 2.0 führen könnte.

Ein Screening innerhalb der Hydrolasen-Familie nach Lactonasen und Lipasen mit der gewünschten Selektivität blieb jedoch erfolglos. Innerhalb der Familie der Esterasen (18 getestete Esterasen) konnten jedoch vier Enzyme identifiziert werden, die die gewünschte Reaktion (teilweise) durchführten. Im Detail waren dies eine Esterase aus Bacillus subtilis (deren Kristallstruktur bereits bekannt ist, siehe pdb 2R11), zwei Esterasen aus der Schweineleber (die Isoenzyme PLE03 und PLE06) sowie eine kommerzielle Roh-Pferdeleberpräparation. Da die Schweineleberesterasen mit den Pferdeleberesterasen strukturell verwandt sind, kann davon ausgegangen werden, dass tatsächlich die Esterasen die Reaktion katalysieren und nicht ein anderes Enzym innerhalb der Pferdeleber-Präparation.

Bis zu 75% Umsatz mit Pferdeleberesterase

Das so zu Modul 2.1 (s. Abb. 3) umfunktionierte ursprüngliche Modul 2.0 (vergleiche Abb. 2) liefert in Anwesenheit von 10 % Methanol (v/v) das gewünschte Produkt 6-Aminohexansäure mit 47 % Umsatz, wenn die Esterase aus Bacillus subtilis für die Ringöffnung zum Einsatz kam. Im Falle der Schweineleberesterase PLE03 wurden 29 % Umsatz erhalten. Das beste Resultat konnte mit der Pferdeleberesterase-Präparation erhalten werden. Hier wurden 75 % des Lactons innerhalb des verbesserten Moduls 2.1 zu 6-Aminohexansäure umgesetzt.

Eine Kombination aus Modul 1 und Modul 2.1 blieb zunächst ineffektiv, weil die Baeyer-Villiger Monooxygenase nur eine geringe Stabilität in Gegenwart von Methanol als Co-Lösungsmittel besitzt. Eine Reduktion von 10 % auf 2 % Methanol führte zu einem Umsatz von 30 % zur 6-Aminohexansäure.

Durch Zugabe von Methanol zum Reaktionspuffer und dem Einsatz von Pferdeleberesterase konnte die Säurefunktion im Rahmen der Ringöffnung des Lactons maskiert werden, wodurch diese Inhibierung und eine daraus resultierende Akkumulierung dieses Intermediates verringert wurde.

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