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LEBENSMITTELANALYTIK

Langzeiterfahrungen in der GC-Routineanalytik von Mykotoxinen

| Autor/ Redakteur: WOLFGANG BRODACZ* / Gerd Kielburger

Die in Europa dominierende Mykotoxingruppe der Trichothecene verursacht durch die Kontamination von Getreide und Mais großen wirtschaftlichen Schaden. Diese toxischen Stoffwechselprodukte der Fusarien (Feldpilze) gefährden weltweit die Gesundheit von Mensch und Tier.Eine Erfahrungsbasis von rund 20 000 Proben in 14 Jahren erlaubt eine fundierte Beurteilung der gesamten Trichothecen- Methode, aber auch der Qualität der GC-Hardware.

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Abb.1: Strukturen von A- und B-Trichothecenen (mit Derivatisierungssubstituenten).
Abb.1: Strukturen von A- und B-Trichothecenen (mit Derivatisierungssubstituenten).
( Archiv: Vogel Business Media )

Die in Europa dominierende Mykotoxingruppe der Trichothecene verursacht durch die Kontamination von Getreide und Mais großen wirtschaftlichen Schaden. Diese toxischen Stoffwechselprodukte der Fusarien (Feldpilze) gefährden weltweit die Gesundheit von Mensch und Tier, sodass die systematische Kontrolle von Zerealien und fertigen Lebens- und Futtermitteln notwendig ist. Eine Erfahrungsbasis von rund 20 000 Proben in 14 Jahren erlaubt eine fundierte Beurteilungder gesamten Trichothecen- Methode, aber auch der Qualität der GC-Hardware.

Während Mykotoxine, beispielsweise Aflatoxine, Zearalenon, Fumonisine, Ochratoxin A oder Patulin, meist mit HPLC-Methoden analysiert werden, bietet die GC für die große Gruppe der Trichothecene viele Vorteile. Besonders die Auftrennung der wichtigsten Schimmelpilzgifte ist mit GC-Kapillaren unterschiedlicher Polarität gut optimierbar.

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Die hochempfindliche Messung mit dem kostengünstigen GC-Standarddetektor (Micro-)ECD ist ein weiteres Argument für die Gaschromatographie. Trichothecene werden in Abhängigkeit vom Vorhandensein einer Carbonyl-Gruppe in Stellung 8 in zwei Gruppen unterteilt (Abb. 1).

B-Trichothecene wie Deoxynivalenol (DON), Nivalenol (NIV), Fusarenon X (Fus X), 3-Acetyldeoxynivalenol (3-AcDON) und 15-Acetyldeoxynivalenol (15-AcDON) besitzen diese C=0-Gruppe und dadurch einen unerwartet hohen ECD-Response, der mit halogenierten Verbindungen vergleichbar ist. Die für die GC notwendige Derivatisierung kann sich z.B. mit einer Silylierung darauf beschränken, die Flüchtigkeit der B-Trichothecene zu erhöhen und die Polarität zu senken. Die resultierenden Trimethylsilyl-Derivate (TMS) behalten so ihren „natürlichen“ ECD-Responsevorteil gegenüber Matrixbestandteilen.

Im Gegensatz dazu erfordern die A-Trichothecene T-2 Toxin, HT-2 Toxin, Monoacetoxyscirpenol (MAS) und Diacetoxyscirpenol (DAS) eine Derivatisierung, die zusätzlich eine wesentliche ECD-Empfindlichkeitssteigerung bewirkt. Zweckmäßig ist es deshalb, möglichst viele Halogenatome an die Zielanalyten zu binden. Die gewählte Perfluoracylierung mit Heptafluorbutyrylimidazol (HFBI) ist eine von mehreren Möglichkeiten.

Probenvorbereitung

Die Aufarbeitung der Proben gliedert sich in eine zweistündige Extraktion mit Acetonitril/Wasser (84/16) und ein Multitoxin Clean-up eines Rohextrakt-Aliquots mittels Festphasenextraktions-Säulen der Firma Romer Labs.

Diese speziell für Mykotoxine vorgefertigten Einweg-Reinigungskartuschen („MycoSep 227 Trich+“) mit einer Mischung von Aktivkohle, Silica, Ionenaustauscherharz eluieren alle Trichothecene und halten einen Großteil der Zerealien-Bestandteile zurück. Nach der jeweiligen Derivatisierung erfolgt die Messung auf zwei GCs mit unterschiedlichen Phasen (Abb. 2).

Eine Reihe von HPLC-Methoden zielt primär auf DON als Leitsubstanz ab, und oft sind dafür komplexe Vorreinigungen oder einzelsubstanzspezifische Immunoaffinitätssäulen notwendig. Während die HPLC zumindest bei einfachen Matrizes wie Weizen und Mais einige B-Trichothecene auftrennen kann, versagen LC-Standarddetektoren bei den A-Trichothecenen mangels geeigneter Chromophore. Sobald komplexe Matrizes wie Lebensmittel und Futtermittel analysiert werden sollen, ist für die HPLC oft eine hochselektive Vorreinigung mittels Immunoaffinitätssäulen (IAC) notwendig.

Dabei gehen außer der Leitverbindung DON alle anderen meist wesentlich toxischeren Trichothecene verloren. Diese sind aber insbesondere bei Lebensmitteln (Kindernahrung) und auch Futtermitteln von besonderem Interesse, da die A-Trichothecene T-2 Toxin und HT-2 Toxin als hochtoxisch gelten. Abgesehen von der LC/MS(/MS) sind die A-Trichothecene praktisch nur mit der GC und GC/MS zugänglich.

Standfeste GC-Säulen

In einem aufwändigen Selektionsverfahren wurde aus vier stationären Phasen die ideale Kombination von unpolarer und polarer Kapillare ermittelt. Für die Optimierung der Säulendimensionierungen und Temperaturprogramme wurden mithilfe der Computer-gestützten GC-Simulation rund zehn Millionen Chromatogramme simuliert und deren Auflösungen verglichen. Die Wahl fiel schließlich auf die beiden sehr temperaturfesten Säulen HP-5ms und DB-35ms von Agilent Technologies.

In der Praxis ist trotz Ausreizen der oberen Temperaturlimits bei hochempfindlicher EC-Detektion auch nach hoher Probenbelastung (tausende Injektionen) nur sehr geringes Bluten feststellbar. Das ist insbesondere bei Phasen höherer Polarität bemerkenswert. Die früher eingesetzten mittelpolaren Säulen waren lange durch niedere Temperaturlimits bzw. hohes ECD-Rauschen über ca. 270°C das schwächste Glied der Kombination. Die neue Arylen-Technologie der zweiten Generation macht die DB-35ms bei den empfindlichen Trichothecen-Derivaten zur hochinerten und belastbaren Routinesäule mit der notwendig hohen Polarität.

Bei der Optimierung der Trennparameter und Wahl der Säulenkombination wurde besonderer Wert auf die vollständige Auftrennung der Toxine und möglichst unterschiedliche Elutionsmuster gelegt. Mitberücksichtigt wurden dabei auch die Substanzen Mirex und DOM-1, die als Retentionszeitreferenz bzw. Surrogate die Identifizierung verbessern bzw. zur Kontrolle der Quantifizierung dienen.

Die Maxime, Ergebnisse auf zwei Säulen in zwei GCs zu verifizieren, hebt nicht nur die Sicherheit der Identifizierung, sondern auch die Quantifizierung durch zwei unabhängige Kalibrierungen auf ein wesentlich höheres Niveau. Nur Auswertungen auf zwei getrennten GC-Systemen lassen im Problemfall den gefürchteten „matrix induced response enhancement“-Effekt sofort erkennen.

Seit der Verwendung der inerten „ms“-Kapillaren und einer konsequenten Vermeidung aktiver Stellen im Splitless-Injektor durch „gold platet seals“ und „single tapered liner“ mit silanisierter Glaswolle, sowie spezieller Konditionierungsroutinen konnte der Effekt auf ein Minimum reduziert werden. Obwohl alle neun Trichothecene als HFB-Derivate am GC aufgetrennt werden können, ist es meist zweckmäßig die A-Trichothecene mit HFBI umzusetzen und die B-Trichothecene als TMS-Derivate zu bestimmen.

Durch die Perfluoracylierung werden auch viele Matrixbestandteile umgesetzt und erhöhen so das chemische Rauschen im ECD-Chromatogramm Mittels GC/MSD können alle neun Trichothecene nach gemeinsamer Derivatisierung bestimmt bzw. abgesichert werden (Abb. 4). Die Routineanalytik mit EC-Detektion ist allerdings kostengünstiger und meist empfindlicher.

Abbildung 5 zeigt Chromatogramme mit einer dotierten Belastung von rund 0,25 mg je Toxin pro kg Kindernährmittel. In Anbetracht der derzeit in der EU für DON diskutierten Höchstwerte von 0,2 bis 1,75 bei Lebensmitteln und Aktions- bzw. Höchstwerten von 0,9 bis 10 mg/kg bei Futtermitteln, kann die Nachweisempfindlichkeit der Methode als sehr zufriedenstellend eingestuft werden.

Robuste GCs

In den letzten 20 Jahren wurden vom Autor vier GCs vom Typ HP 5890 permanent für die Routineanalytik von Pestiziden, Mykotoxinen, FSME, Sterolen etc. eingesetzt. Neben den Standard-Detektoren ECD, NPD und FID war auch zusätzlich die GC/MS (HP 5970 bis Agilent 5973N) für PAH-Bestimmungen und Absicherungen bzw. Methodenentwicklungen im Einsatz. Obwohl rund um die Uhr in Verwendung, traten nie relevante Schäden auf (Das Recoaten der NPD-Perle, sowie Wechseln von Liner, Septen und Autosampler-Spritzen sind als übliche Routinewartungen zu werten.).

Trotz hoher Dauerbelastung durch Matrixkontaminationen und Säulenbluten ergaben sich selbst bei den notwendigerweise gesteigerten Empfindlichkeitsansprüchen lediglich Intervalle von sieben bis zehn Jahren für den Austausch der ECD-Zellen (Ni-63). Auch die mechanisch durch die geforderten kurzen Nadelverweilzeiten stark beanspruchten Autosampler (HP/Agilent) gaben kaum Anlass zur Sorge. Oft reichte der (kostenlose) telefonische Rat von Servicetechnikern aus, den Injektionsautomaten wieder in Gang zu bringen. Ansonsten wurden Verschleißteile rasch erneuert oder ein Austausch gegen generalüberholte Auto-Injektoren etc. (Postversand) durchgeführt.

Im Zusammenhang mit der Langzeitzuverlässigkeit des Probenaufgabesystems kann auch das Merlin-Microseal empfohlen werden. Seit der Verfügbarkeit dieses speziellen „Septenersatzes mit Funktion“ gehörten viele Injektorprobleme der Vergangenheit an. Keine absorbierenden und blutenden Krümel mehr im Liner, keine plötzlich über Nacht undichten Septen mehr, die den Verlust der ganzen Sequenz (falsche Quantifizierung und Retentionszeiten; angestochene Vials mit zersetzten Proben) zur Folge hatten.

Neue GCs - neue Features

Mit dem Wechsel vom HP 5890 auf das Nachfolgemodell Agilent 6890N ergaben sich eine Reihe von analytischen und wirtschaftlichen Vorteilen:

Der neue Micro-ECD zeigt durch das reduzierte Zellvolumen (1/10) wesentlich bessere Empfindlichkeit bei reduziertem Gasverbrauch. Die Anodenspülung minimiert die Kontamination der Ni-63-Zelle und verlängert die Austauschintervalle.

Ein EPC der neuesten Generation erlaubt durch präzise „Pressure Pulse“-Injektionen deutlich größere Injektionsvolumina (Empfindlichkeits-Steigerung) bzw. beschleunigten Transfer empfindlicher Analyten in die Kapillare (reduziert Adsorptions- und Zersetzungsgefahr).

Die Elektronische Gasflussprogrammierung reduziert den Gasverbrauch („Gas Saver“ für Injektor und Detektor).

Ein thermisch schnellerer Ofen spart Zeit beim Aufheizen und besonders beim Abkühlen (Steigerung des Probendurchsatzes).

Neue Autosampler-Features erhöhen die Flexibilität bei der Methodenentwicklung.

Fazit

20 Jahre zufriedenstellender Dauereinsatz der HP 5890-GCs, davon vierzehn Jahre auch in der Mykotoxinanalytik, bezeugen sowohl die Ausgereiftheit der Trichothecen-Methode als auch die Robustheit der Geräte. Die Erweiterung der GC-Methoden um die neuen Möglichkeiten des Nachfolgers Agilent 6890N resultiert in einer deutlichen Empfindlichkeitssteigerung bei reduzierten Betriebskosten. Der doppelte Aufwand für die Verifizierung mit zwei GCs wird durch die enorm gesteigerte Identifizierungssicherheit und wesentliche Verbesserung der Quantifizierung gerechtfertigt.

*W. Brodacz, AGES Kompetenzzentrum Cluster Chemie, 4021 Linz, Österreich

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