CHROMATOGRAPHIE Methodenoptimierung in der HPLC

Das wichtigste Werkzeug bei der Methodenentwicklung in der HPLC ist die Selektivität der stationären Phase. Deren Stellenwert ist allein an der Anzahl kommerziell verfügbarer RP-Phasen abzulesen. Derzeit liegt die Zahl bei 750 und jährlich kommen neue Packungsmaterialien hinzu.

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Das wichtigste Werkzeug bei der Methodenentwicklung in der HPLC ist die Selektivität der stationären Phase. Deren Stellenwert ist allein an der Anzahl kommerziell verfügbarer RP-Phasen abzulesen. Derzeit liegt die Zahl bei 750 und jährlich kommen neue Packungsmaterialien hinzu. Aus dieser großen Anzahl von HPLC-Phasen muss der Anwender die richtige Säule für seine Applikation finden. Die neue Phasenoptimierte Flüssigkeitschromatographie, POPLC, eröffnet jetzt völlig neue Möglichkeiten bei der Methodenoptimierung in der HPLC.

Die Suche nach der passenden Säule gestaltet sich häufig sehr schwierig und muss nicht selten durch eine aufwändige Optimierung der mobilen Phase kompensiert werden. Gelingt es, eine geeignete stationäre Phase für eine Trennung zu finden, ist die Optimierung der Trennung wesentlich einfacher. Mit Hilfe der neuen Phasen-optimierten Flüssigkeitschromatographie (POPLC) wird hier ein neuer Weg der Methodenoptimierung beschritten. Nach einer groben Auswahl der mobilen Phase wird nur die stationäre Phase optimiert. Die POPLC basiert auf der Theorie des Prisma-Modells, die schon früher zur Optimierung der flüssigchromatographischen mobilen Phase eingesetzt wurde. Abbildung 1 zeigt ein solches Prisma.

Hierbei repräsentiert die Höhe der Schenkel des Prismas die Retentionsstärke der eingesetzten stationären Phasen für einen entsprechenden Analyten. Die optimale Retentionsstärke für diesen Analyten liegt irgendwo in der Fläche, die vom Prisma aufgespannt wird, und kann durch geschickte Kombination der einzelnen stationären Phasen A, B und C eingestellt werden. Zur Kombination der einzelnen stationären Phasen wird ein segmentiertes Säulensystem verwendet (Abbildung 4).

Stand der Technik

Bei der Methodenentwicklung in der HPLC haben sich folgende Vorgehensweisen etabliert: Zunächst erfolgt ein „Screening“ von mehreren grundsätzlich verschiedenen HPLC-Säulen wie C18, polar embedded C18 oder Phenyl. Bei diesem Verfahren werden schnelle Gradienten über kurze Trennsäulen gefahren und so die stationäre Phase mit der besten Antrennung ermittelt und diese zur weiteren Optimierung der mobilen Phase als optimierte Trennsäule herangezogen. Anschließend erfolgt die Optimierung der mobilen Phase. Dabei wird der pH-Wert, die Art des organischen Lösemittels (protisch oder aprotisch), dessen Lösemittelstärke, sowie die Konzentration und die Art des Puffers optimiert. Diese Optimierung geschieht häufig intuitiv, es kommt aber auch gelegentlich Software zum Einsatz, die den Anwender bei dieser Arbeit unterstützt. Das Ziel jeder Optimierung ist es, eine möglichst robuste Trennung zu erreichen, d.h. eine Trennung aufrechtzuerhalten, auch wenn die Zusammensetzung der mobilen Phase, deren pH-Wert oder die Temperatur innerhalb gewisser Grenzen schwanken.

POPLC - ein neuer Ansatz

Die Methode der POPLC beschreitet einen völlig neuen Weg der Methodenoptimierung. Hier wird nach einer groben Auswahl der mobilen Phase primär die stationäre Phase optimiert. Dazu wird ein segmentiertes Säulensystem verwendet. Zunächst wird aus der Erfahrung heraus oder mittels Vorversuchen eine mobile Phase gewählt und auf verschiedenen stationären Phasen die Retentionszeiten für alle Komponenten bestimmt. Für diese Basismessungen werden in ihrer Selektivität möglichst unterschiedliche stationäre Phasen verwendet. Diese wären z.B. C18, polar embedded C18 und Phenyl, aber auch C30 oder Cyanopropyl. Das Retentionsverhalten der verschiedenen Verbindungen ist auf den unterschiedlichen stationären Phasen naturgemäß nicht identisch, weil jede stationäre Phase mit unterschiedlichen Stellen des Moleküls verschieden starke Wechselwirkungen eingeht. Die gemessenen Retentionszeiten auf den unterschiedlichen stationären Phasen werden dann in eine Optimierungssoftware eingegeben und daraus die optimale Zusammensetzung der Trennsäule berechnet.

Applikationsbeispiel

Das folgende Beispiel veranschaulicht eindrucksvoll die Möglichkeiten der Methode. Beschrieben ist hier die Trennung von Triazinen. Hierbei handelt es sich um Pestizide, die gelegentlich im Grundwasser gefunden werden. Die Trennung ist nicht ganz einfach, da die Analyten sowohl von ihrer Struktur, als auch von ihrer Hydrophobie sehr ähnlich sind. In Abbildung 2 ist klar erkennbar, dass es auf keiner der vier einzelnen stationären Phasen zu einer vollständigen Trennung kommt. Auf einer C18-Phase (A) kommt es zu einer Koelution von Simetryn und Ametryn (Peak 2 und 3), sowie Terbutryn und Simazin (Peak 5 und 6). Auf einer C18-Phase mit eingebundener polarer Gruppe (B) sind letztere Verbindungen zwar getrennt, jedoch kommt es diesmal neben der Koelution von Simetryn und Ametryn (Peak 2 und 3) zum Zusammenfallen der Peaks sieben und acht (Atrazin und Propazin).

Auf der Phenylphase (C) ist die Sachlage wieder völlig anders. Hier hat man eine gute Trennung der vorher kritischen Peakpaare 2/3, 5/6 und 7/8. Dafür kommt es auf dieser stationären Phase zu einer Koelution von Prometryn und Terbutryn (Peak 4 und 5), die auf den anderen stationären Phasen völlig problemlos zu trennen waren. Der Grund für dieses Trennverhalten liegt auf der Hand: Während die Phenylphase primär nach Wechselwirkungen mit dem p-Elektronensystem trennt, wird auf der C18-Phase rein nach der Hydrophobie der Analyten getrennt. Auf der Cyanopropylphase (D) ist die Retention sehr gering, jedoch ist erkennbar, dass auch diese stationäre Phase wieder eine völlig andere Selektivität besitzt als die anderen.

Auf keiner der stationären Phasen kann somit das Trennproblem gelöst werden. Wie Abbildung 3 zeigt, ist dies jedoch mittels einer Kombination von drei dieser stationären Phasen sehr wohl möglich. Die optimale Säulenzusammensetzung besteht aus drei Teilen Phenyl und je einem Teil Cyanopropyl und C18 mit eingebundener polarer Gruppe. Die Trennung wurde auf einer 300 mm langen Trennsäule bestehend aus 180 mm Phenyl, 60 mm Cyanopropyl und 60 mm C18 mit eingebundener polarer Gruppe erhalten. Die Optimierungssoftware erlaubt es, die Trennung nach verschiedenen Kriterien zu optimieren. Neben der besten Auflösung oder höchsten Selektivität kann auch nach der besten Trennung innerhalb einer bestimmten Analysenzeit optimiert werden, was selbstverständlich in unterschiedlichen Zusammensetzungen und Längen der jeweils optimalen Trennsäule mündet.

Vorteile der Methode

Die Methode weist gegenüber der herkömmlichen Optimierung von HPLC-Trennungen folgende Vorteile auf:In vielen Fällen kann auf eine Gradientelution verzichtet werden, da die optimale Kopplung der stationären Phasen die Retentionszeiten der einzelnen Analyten steuert. Kann eine Trennung isokratisch durchgeführt werden, vereinfacht dies den apparativen Aufwand, führt zu einem konstanten Untergrund für die Detektion und zu kürzeren Analysenzeiten, weil auf die Reäquilibrierung nach Gradientläufen verzichtet werden kann. Ein konstanter Untergrund ist v.a. bei massenspektroskopischer Detektion sehr wichtig, da schwankende Eluenten-Zusammensetzungen zu unterschiedlicher Ionisierung der Analyten führen können.

Wie aus Abbildung 4 hervorgeht, kann auch die Säulenlänge in der POPLC völlig flexibel an das jeweilige Trennproblem angepasst werden. Es gilt die Devise: So kurz wie möglich, aber so lang wie nötig. Bei einfachen Trennungen können auch sehr kurze Trennsäulen zusammengesetzt werden, was zu optimierten Analysenzeiten führt.

Die Software-unterstützte Methodenoptimierung vereinfacht den kompletten Prozess. Die Methodenoptimierung erfolgt nach der Eingabe der Retentionsdaten der einzelnen Analyten, die auf den jeweiligen Basissegmenten gemessen wurden, vollautomatisch durch die POPLink-Optimizer Software.

Fazit

POPLC eröffnet dem Anwender völlig neue Möglichkeiten bei der Methodenoptimierung in der HPLC, da zum ersten Mal die Selektivität der Trennsäule völlig flexibel auf das jeweilige Trennproblem angepasst werden kann. Die segmentierten Trennsäulen erlauben eine einfache Methodenoptimierung und auch die Übertragung von Gradientmethoden zu isokratischen Methoden auf nur einer Säule.

*Dr. S. Lamotte, Bischoff Analysentechnik und -geräte GmbH, 71229 Leonberg

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