STED-Mikroskopie Mit STED-Mikroskopie zelluläre Nanostrukturen erforschen

Die Geheimnisse des Lebens und die Entstehung vieler Krankheiten lassen sich erst vollständig erklären, wenn wir wissen, wie kleinste Bausteine des Organismus funktionieren. Mit dem super-hochauflösenden STED-Mikroskop von Leica Microsystems können Forscher heute Proteine und molekulare Strukturen in den Zellen beobachten, die wenige Nanometer klein sind.

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Als Ernst Abbe 1873 die Grundlagen der Theorie formuliert hatte, dass die maximale lichtmikroskopische Auflösung auf die halbe Lichtwellenlänge von rund 200 bis 350 Nanometer begrenzt sei, dachte noch niemand daran, mit Lichtmikroskopen wenige Nanometer kleine Strukturen zu betrachten. Aber gerade für deutlich kleinere Proteine und intrazelluläre Strukturen interessieren sich biomedizinische Forscher besonders. Zu beobachten, wie Proteine und andere molekulare Komplexe sich bewegen, funktionieren und zusammenwirken, hilft zu verstehen, wie Prozesse des Lebens funktionieren oder wie Krankheiten entstehen und behandelt werden können.

Der entscheidende Durchbruch gelang dem Physiker Prof. Stefan Hell, Leiter der Abteilung für NanoBiophotonik am Max-Planck-Institut Göttingen. Er entwickelte Fluoreszenzmikroskope, mit denen er das Abbesche Gesetz überlistete. Mit dem super-hochauflösenden STED-Mikroskop können bis zu 20 Nanometer kleine Details aufgelöst werden. Erste STED-Systeme, die Leica Microsystems in Exklusivlizenz herstellt und vertreibt, sind bereits im Einsatz, beispielsweise, um die Signalübertragung in den Nervenzellen zu erforschen.

Beobachtung der neuronalen Signalübertragung

Dr. Silvio Rizzoli vom European Neuroscience Institute (ENI) und Exzellenzcluster Mikroskopie im Nanobereich am DFG Forschungszentrum Molekularphysiologie des Gehirns (CMPB) in Göttingen gehört zu den Vorreitern der STED-Anwendung und sammelte bei der Erforschung der Signalübertragung in Nervenzellen Erfahrungen mit dem System. „Vesikel, die Neurotransmitter in der Synapse vorrätig halten und zur Signalübertragung an der Zellmembran freisetzen, zählen mit 40 bis 50 Nanometern zu den kleinsten Organellen der Nervenzelle. Erst mit STED konnten wir einzelne Vesikel lokalisieren, die meist in Gruppen von 100 bis 300 Vesikeln vorkommen. Wir beobachten, dass sie sich nicht wie bisher angenommen nur wenig, sondern ständig, wie zufällig sehr schnell hin- und herbewegen. Dies war für uns unvorstellbar, denn die Signalübertragung ist ein hochkomplexer, kontrollierter Prozess. Es ist uns gelungen, ein erstes Live-Video dieser Vorgänge aufzunehmen“, sagt Dr. Rizzoli. Auch die Erkenntnisse über den Prozess des Vesikel-Recyclings an der Zellmembran hätten sich mithilfe von STED grundlegend verändert. Es konnte beobachtet werden, dass Vesikelmoleküle nach Verschmelzen mit der Zellmembran wie ein Öltröpfchen in Wasser zusammenhängen, was das Recycling der Vesikel erleichtert.

„STED hat demonstriert, dass die bisherige Auflösungsgrenze überwindbar ist. Inzwischen versuchen viele Labors, neue super-hochauflösende Verfahren zu entwickeln. Aber STED ist hier am weitesten und die einzige Technologie, die wirklich funktioniert. STED war eine Art Initialzündung für einen regelrechten Technologiewettlauf“, beurteilt Dr. Rizzoli die Zukunft der Technologie.

Bruchpilot und Fruchtfliege

Prof. Dr. Stephan Sigrist, Institut für Biologie, Freie Universität Berlin und NeuroCluster of Excellence an der Charité in Berlin, untersucht die präsynaptische Signalübertragung und interessiert sich besonders für ein Protein, das Bruchpilot genannt wird. „Mit STED können wir hier erstmals Licht ins Dunkle der Synapse bringen. Wir erkennen Substrukturen und können Proteine lokalisieren. Bruchpilot spielt eine zentrale Rolle in den Synapsen der Fruchtfliege, indem es dort eine spezifische Struktur zur Unterstützung der Signalübertragung aufbaut. Hat die Fliege wenig Bruchpilot, stürzt sie ab; hat sie gar kein Bruchpilot, stirbt sie. Das Protein kommt in ähnlicher Form auch beim Menschen vor und könnte mit Erkrankungen des Nervensystems in Zusammenhang stehen. Tierstudien helfen, die Proteinfunktionen beim Menschen zu verstehen. Wahrscheinlich lösen synaptische Defekte viele neurodegenerative Erkrankungen aus. Zudem werden auch Erinnerungs- und Lernprozesse mit großer Sicherheit an Synapsen organisiert“, erklärt Prof. Sigrist. „Mit STED dringen wir in den Bereich von Proteinkomplexen vor. Zur Zeit können wir Strukturen unterhalb 100 Nanometer auflösen. Professor Hell, der an der Weiterentwicklung von STED arbeitet, hat im Labor bereits weitaus höhere Auflösungen realisiert. Wenn wir Auflösungen von wenigen zehn Nanometern nutzen können, sind lichtmikroskopische Aussagen darüber möglich, ob Proteine nahe beieinander liegen oder weiter entfernt sind. Für das Verständnis der Proteinfunktionen wäre dies ein weiterer Quantensprung“, freut sich Prof. Sigrist.

Morphologische Untersuchungen von Zellstrukturen

Dr. Gregorz Wilczynski vom Laboratory of Molecular and Systemic Neuromorphology, Nencki Institute of Experimental Biology in Warschau, Polen, führte bisher mittels Elektronenmikroskopie morphologische Untersuchungen von dendritischen Zellstrukturen durch. Durch den Einsatz der STED-Mikroskopie eröffneten sich auch für ihn völlig neue Möglichkeiten: „Die meisten Synapsen befinden sich auf 200 nm bis 2 μm kleinen dentritischen Ausstülpungen, den Dornfortsätzen. Ihre unterschiedlichen Formen und Größen beeinflussen wahrscheinlich maßgeblich die Signalübertragung. Veränderungen der Dornfortsätze spielen auch eine Rolle bei Krankheiten wie Epilepsie und der Erbkrankheit Fragiles-X-Syndrom. Mit STED können wir den bisher noch nicht sehr gut erforschten Formenreichtum der Dornfortsätze nun sehr viel detaillierter untersuchen als mit konventioneller Konfokalmikroskopie und sehr viel mehr Analysen durchführen als mit der Elektronenmikroskopie. Mit STED untersuchen wir mehrere Tausend Dorfortsätze in der gleichen Zeit, in der wir mit EM nur 200 bis 300 schaffen.“

Laut Dr. Wilczynski wird die Bedeutung der super-hochauflösenden Lichtmikroskopie ganz sicher weiter steigen, und selbst Technologien wie STED werden in punkto Auflösung noch besser werden. „Auch im Vergleich zur EM sehe ich Vorteile. Wenn wie in unserem Fall morphologische Untersuchungen von Zellstrukturen, die bisher nur mit aufwändiger EM möglich waren, nun in sehr viel kürzerer Zeit mit STED realisierbar sind“, sagt Dr. Wilczynski.

* A. Schué, Corporate Communications, Leica Microsystems, 35578 Wetzlar

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