Thermische Analyse Moderne Dynamische Differenzkalorimetrie in Pharma und Biotechnologie

In pharmazeutischen oder biotechnologischen Labors müssen eine große Anzahl von Proben bearbeitet werden. Eine automatisierbare und effiziente Analytik, die gleichzeitig eine Vielzahl unterschiedlicher Informationen über das Probenmaterial liefert, ist deshalb enorm wichtig. Auch die moderne thermische Analyse gehört zu den Methoden, die diese Möglichkeiten bieten. Forscher haben nun eine moderne Dynamische Differenzkalorimetrie (DSC) -Methode entwickelt, die den Anforderungen gerecht wird.

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Forschende, pharmazeutische und bio-technologische Firmen investieren durchschnittlich 5 bis 20 Prozent ihrer Umsätze wieder in Forschung und Entwicklung neuer Produkte. Auf Grund der steigenden Anforderungen und den zunehmenden Regulationen, benötigt die Entwicklung eines neuen Medikamenten-Wirkstoffes bis zum vermarktbaren Endprodukt durchschnittlich 12 bis 15 Jahre. In dieser Zeit übersteht nur eine von 5000 bis 10 000 erfolgversprechenden Substanzen die Testphasen bei typischen Kosten von einer knappen Milliarde Euro. Da eine patentierte Substanz nur etwa 20 Jahre ab Anmeldung geschützt ist, bleiben dem Unternehmen nur fünf bis acht Jahre für die Vermarktung. Es existiert somit ein ständiger Druck, neue Wirkstoffe zu entdecken und in möglichst kurzer Zeit einzuführen. Eine automatisierbare, effiziente Analytik, die gleichzeitig eine Vielzahl unterschiedlicher Informationen über ein Probenmaterial liefert, ist daher unabdingbar für das pharmazeutische oder biotechnologische Labor. Die Thermische Analytik liefert alle Voraussetzungen, um auch in diesem Bereich eingesetzt zu werden.

In Abbildung 1 sind die Möglichkeiten der Thermischen Analytik in der pharmazeutischen und biotechnologischen Qualitätssicherung, Forschung und Produktentwicklung zusammengefasst.

Thermische Analyse umfasst eine Reihe von Techniken von denen die Dynamische Differenzkalorimetrie (engl. DSC) die bekannteste ist. Bei dieser Analytik wird eine Probe einem definierten Temperaturprogramm unterworfen – sie wird also erhitzt oder abgekühlt. Gleichzeitig wird die abgegebene (exotherm) oder aufgenommene (endotherm) Wärmetönung gemessen. Diese wiederum lässt Rückschlüsse auf die chemischen oder physikalischen Prozesse, z.B. Schmelzen, Kristallisieren oder polymorphe Umwandlungen, innerhalb des Probenmaterials zu.

Kompatibilität von Wirk- und Hilfsstoffen

Bei der Entwicklung pharmazeutischer Rezepturen spielt unter anderem die Kenntnis der Wechselwirkungen zwischen zwei oder mehreren Komponenten eine wichtige Rolle. Es treten hierbei sowohl erwünschte wie unerwünschte Wechselwirkungen auf.

Erwünschte Wechselwirkungen werden zielgerichtet herbeigeführt, um z.B. die Löslichkeit eines Wirkstoffs zu verbessern. Unerwünschte Wechselwirkungen führen zu Veränderungen bei einem oder mehreren Bestandteilen mit dem Ergebnis einer verminderten Wirkung oder völliger Unwirksamkeit. Pharmazeutische Präparate lassen sich diesbezüglich mittels DSC durch Vergleich der Ergebnisse von einzelnen Komponenten mit deren Mischung untersuchen. Lassen sich die Komponenten ohne Veränderung mischen und weist die Mischsubstanz thermische Effekte als Summe der Einzelsubstanzen auf, ist dies ein Hinweis auf Kompatibilität.

Pharmazeutische Endprodukte bestehen häufig aus einer Vielzahl an Komponenten mit unterschiedlichen Funktionen. Da in solchen komplexen Formulierungen überlappende, thermisch induzierte Effekte auftreten können, ist eine eindeutige Interpretation der erhaltenen DSC-Messkurven häufig schwierig oder sogar unmöglich. Neue Methoden wie die frequenzabhängige, temperaturmodulierte DSC-Technik (Topem) sind in derartigen Fällen entscheidend.

Die temperaturmodulierte Dynamische Differenzkalorimetrie (DSC)

An einem Beispiel soll die Leistungsfähigkeit dieser Methode erläutert werden: wie die in schwarz dargestellte DSC-Messkurve im unteren Teil der Abbildung 2 zeigt, treten bei der pharmazeutischen Formulierung mehrere, überlagerte Effekte auf. Sichtbar sind ein breiter Effekt zwischen 30 und 140 °C, sowie zwei scharfe Effekte bei etwa 60 und 125 °C. Eine derartige, konventionelle DSC-Messung liefert keine weiteren Informationen über die Natur der beobachteten, überlappenden Probeneffekte oder gar über Effekte die durch das breite Signal völlig verdeckt sein könnten. Die Temperaturmodulierte DSC allerdings, ist nun in der Lage, überlagerte, reversierende von nicht-reversierenden Effekten durch eine einzige Messung zu trennen. Konventionelle DSC misst immer nur die Summe aus beiden.

Im dargestellten Beispiel zeigen die durch die temperaturmodulierte Technik erhaltenen Ergebnisse (Wärmekapazität cp0, rote Kurve und nicht-reversierendes DSC-Signal, blaue Kurve), dass der Effekt bei 60 °C eigentlich aus einer Glasumwandlung mit überlagerter Enthalpierelaxation besteht, während der zweite bei etwa 125 °C durch eine Phasenumwandlung hervorgerufen wird. Letzteres kann aus der Frequenzunabhängigkeit des Peakmaximums (cp0-Kurve) geschlossen werden.

Der breite Effekt zwischen 30 und 140 °C wird durch Verdampfen von Feuchtigkeit hervorgerufen. Durch Integration dieses Effekts im nicht-reversierenden Signal kann zudem der Feuchtigkeitsgehalt der Probe errechnet werden. Er beträgt im gemessenen Beispiel 6,5 Prozent. Mithilfe dieser Technik ist man also in der Lage überlagerte DSC-Messeffekte zu trennen und besitzt dadurch eine herausragende Möglichkeit Messkurven und damit auch die Probenmaterialien in ihrer Komplexität besser zu verstehen.

Entdeckung polymorpher Substanzformen

Ein nicht weniger wichtiges Anwendungsgebiet der DSC ist die Möglichkeit, polymorphe Substanzformen aufzuspüren. Polymorphie bedeutet, dass eine Substanz in verschiedenen Erscheinungsformen, trotz gleicher chemischer Struktur, auftreten kann. Bekanntes Beispiel sind die Modifikationen des Kohlenstoffs: Diamant, Graphit und Fullerene.

Polymorphe Formen haben unterschiedliche Eigenschaften wie z.B. Schmelzpunkt oder Lösungsgeschwindigkeit. Letztere wiederum bestimmt die Bioverfügbarkeit. Daher ist es besonders wichtig einen neuen Wirkstoff auf Polymorphismus zu testen. Durch DSC-Messungen kann auf einfache Art und Weise herausgefunden werden, ob unterschiedliche Kristallstrukturen gebildet werden. Vor allem durch die Wahl verschiedener Aufheiz- oder Abkühlgeschwindigkeiten lassen sich die Umwandlungen auf Grund ihrer Kinetik sichtbar machen und interpretieren.

Eine Besonderheit stellt die Analyse optisch aktiver Substanzen dar. Die beiden Enantiomere, die sich wie Bild und Spiegelbild, verhalten, können ein 1:1-Gemisch bilden, das sogenannte Racemat.

Während die beiden reinen Enantiomere mittels DSC nicht unterschieden werden können, da ihre Kristalle exakt gleiche thermische Daten aufweisen, unterscheidet sich das Racemat bezüglich Schmelztemperatur und -wärme meist deutlich von den Werten der reinen Enantiomere. Die Zugabe des jeweils anderen Enantiomers zu einem reinen Enantiomer führt also zu einer Veränderung des Schmelzverhaltens und damit auch der Gestalt der DSC-Messkurve.

Einsatz der thermischen Analyse in der Biotechnologie

Die weiße Biotechnologie beschreibt die Produktion von organischen Fein- und Grundchemikalien mithilfe optimierter Enzyme oder Mikroorganismen im industriellen Maßstab. Enzyme spielen also eine besondere Rolle bei biotechnologischen Verfahren und bedürfen daher eines erweiterten Verständnisses ihrer Struktur und Funktionsweise. Sie wurden bisher, wegen der sehr schwachen, thermisch induzierten Effekte, traditionell mithilfe von Mikrokalorimetern untersucht. Neue Sensortechnologien machen es nun möglich derartige Effekte auch mit Wärmestrom-Differenzkalorimetern zu erfassen. Das Beispiel in Abbildung 3 zeigt die Denaturierung des Enzyms Lysozym in einer Pufferlösung (pH 3). Beide Messkurven (1,7 bzw. 0,1 Prozent Lysozym) wurden durch Subtraktion der Messkurve der reinen Pufferlösung (rot) korrigiert. Entscheidend ist, dass der endotherme Effekt der Denaturierung auch noch deutlich bei sehr kleiner Konzentration (hier 0,1 Prozent) nachgewiesen werden kann. Die Auswertung ergibt für Lysozym eine Peakhöhe von 6,7 µW.

Tabletten-Verpackungen thermisch analysieren

Nicht zuletzt können mithilfe der DSC relevante Informationen über die Verpackung pharmazeutischer oder biotechnologischer Substanzen gewonnen werden. Kapseln oder Blister für Tabletten werden häufig aus Kunststoffen hergestellt, die sich wiederum mittels DSC charakterisieren lassen.

Thermische Analyse im Allgemeinen und Dynamische Differenzkalorimetrie im Besonderen sind effiziente Methoden um pharmazeutische und biotechnologische Prozesse zu begleiten und wertvolle, vielfältige Informationen zu liefern.

*Dr. D. Neff, Mettler Toledo GmbH, 35396 Gießen

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