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ICSI: Intrazytoplasmatische Spermieninjektion Morphologische Selektion mittels hochauflösender Mikroskopie

Autor / Redakteur: Anja Schué* / Dipl.-Chem. Marc Platthaus

Wenn Standardmethoden wie in-vitro-Fertilisation (IVF) oder intrazytoplasmatische Spermieninjektion, kurz ICSI, nicht zur Befruchtung der Eizelle führen, ist häufig die Qualität der Spermien die Ursache. Bei der intrazytoplasmatischen morphologisch selektierten Spermieninjektion (IMSI) werden mithilfe hochauflösender Mikroskopie Spermien gezielt nach morphologischen Kriterien ausgewählt, die nicht im Zusammenhang mit DNA-Schädigungen stehen.

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Nachdem Louise Brown 1978 als erstes Retortenbaby das Licht der Welt erblickte, sind mithilfe der Reproduktionsmedizin über drei Millionen Babys gezeugt worden; jährlich kommen rund 200 000 hinzu. Über die Hälfte aller Behandlungen werden in den USA, Deutschland, Frankreich, Großbritannien, Spanien und Italien durchgeführt. Das interdisziplinäre Centre Médico-Chirurgical et Obstétrical (SIHCUS-CMCO) in Straßburg zählt zu den führenden öffentlichen Zentren für Reproduktionsmedizin in Frankreich. Professor Stéphane Viville, Leiter der Abteilung für Reproduktionsbiologie, und Dr. Christiane Wittemer, Leiterin des Labors für assistierte Reproduktion, behandeln jedes Jahr rund 2000 ungewollt kinderlose Paare. Seit 2005 ist das Centre Médico-Chirurgical eins von drei Zentren in Frankreich, die mit IMSI arbeiten. Gemeinsam mit weiteren Instituten in Frankreich ist eine Multi-Center-Studie zu IMSI geplant.

Aktive Nachhilfe für Spermien – die klassische ICSI

Bei der klassischen intrazytoplasmatischen Spermieninjektion (ICSI) wird eine Samenzelle direkt in das Zytoplasma der Eizelle injiziert, um bei eingeschränkter Spermienzahl oder -beweglichkeit die Chancen auf eine Befruchtung zu erhöhen. Diese aktive Nachhilfe für die Spermien erzielt allerdings ähnliche Erfolgsraten wie die in-vitro-Fertilisation (IVF). Eine Ursache für nicht erfolgreiche ICSI-Versuche liegt in der Methode selbst, denn das Zusammenführen von Ei- und Samenzelle ist nicht allein ausschlaggebend. Die Eizelle wird quasi gezwungen, das zugeführte Spermium aufzunehmen.

Natürliche Auswahlkriterien sind außer Kraft gesetzt, wobei noch völlig unbekannt ist, nach welchen Kriterien die Eizelle entscheidet.

Gutes Aussehen überzeugt

Studien haben gezeigt, dass geringe Spermienqualität die Embryoentwicklung beeinflussen kann und oft für Misserfolge verantwortlich ist. Paternale Faktoren wie DNA-Fragmentation, Zytoplasma-Retension, chromosomale Aberrationen, apoptopische Prozesse oder peristierende Histone haben ihre Ursache meist in einer verminderten Spermienreife. Das Auftreten von defekter DNA korreliert positiv mit abnormer Morphologie. Chromosomale Veränderungen kommen bei Spermien mit amorphen Köpfen viermal häufiger vor als bei normal geformten Spermien. DNA-Schäden, die bei der Chromatin-Umwandlung während der Spermienreife entstehen, stehen vermutlich mit intranuklearen Vakuolen im Zusammenhang. Feinmorphologische Untersuchungen haben die Integrität des Zellkerns (gleichmäßige Form, keine Vakuolen) als wichtigsten Parameter für eine erfolgreiche Spermieninjektion ermittelt. Ob allerdings das morphologisch und funktionell beste Spermium ausgewählt wurde, kann bei ICSI nicht ermittelt werden. Mit der üblichen 200x- bis 400x-Vergrößerung sind intrazelluläre Strukturen nicht erkennbar.

Morphologische Selektion – Erweiterung der ICSI zur IMSI

Auf der Basis dieser Erkenntnisse hat der israelische Biochemiker und Androloge, Professor Benjamin Bartoov, vor vier Jahren ICSI zur IMSI-Methode weiterentwickelt. Um Missbildungen bei Spermien sichtbar zu machen, setzte er eine 6000x- bis 8000x-Vergrößerung ein. Dies ermöglichte erstmals ein Real-Time-Screening ohne Färbung sowie die gezielte Selektion von Samenzellen mit bestmöglicher morphologischer Integrität.

Bei IMSI zählen Spermien zur ersten Wahl, wenn der Nukleus höchstens eine Vakuole enthält oder mehrere kleine, die insgesamt weniger als vier Prozent der Gesamtfläche einnehmen, und wenn der Kopf glatt, symmetrisch und oval geformt ist. Spermien zweiter Wahl besitzen große Vakuolen bzw. abnorm geformte Zellkerne. Ausgeschlossen werden möglichst alle übrigen pathologischen Formen, die Missbildungen an Kopf, Mittelstück oder Schwanz aufweisen, bzw. juvenile Formen.

Um die Bedeutung der Spermienmorphologie zu untersuchen, führten Prof. Viville und Dr. Wittemer eine Studie mit 55 Paaren mit fehlgeschlagenen Intra-uterinen-Inseminations-Behandlungen (IUI) durch. An geteilten Schwestereizellen wendeten sie IVF bzw. ICSI an. Mithilfe des hochauflösenden Mikromanipulationssystems Leica AM6000-Big-S begutachteten sie pro Probe mindestens 100 Spermien bei 12 500x-Vergrößerung. Das Screening ergab, dass 7,6 Prozent aller Spermien frei von Abnormitäten waren. 64,9 Prozent wiesen mehrere Vakuolen im Zellkern auf, zum Teil auch zusätzliche Verformungen des Kopfes (20,7 Prozent) oder Defekte am Mittelstück (12,3 Prozent).

Die Paare wurden in zwei Gruppen eingeteilt. Gruppe I (33 Paare) mit weniger als acht Prozent normalen Spermien und Gruppe II (22 Paare) mit mehr als acht Prozent normalen Spermien. In Gruppe I konnte mit ICSI eine gegenüber IVF signifikant höhere Befruchtungsrate erzielt werden: 75,9 Prozent gegenüber 38,9 Prozent (s. Tabelle 1). Auch in Gruppe II erzielte die ICSI-Methode tendenziell höhere Raten (76,3 Prozent gegen 65,7 Prozent,p über 0,05). Die IVF-Befruchtungsrate lag in Gruppe I mit 38,9 Prozent gegen 65,7 Prozent signifikant niedriger als in Gruppe II. Die Anzahl befruchteter ICSI-Eizellen war in beiden Gruppen hoch und damit vom Anteil an normalen Spermien nicht signifikant beeinflusst (75,9 Prozent in Gruppe I und 76,3 Prozent in Gruppe II). Die Implantationsraten waren in beiden Gruppen wiederum signifikant unterschiedlich. 12,5 Prozent bei Gruppe I und 18,5 Prozent bei Gruppe II (p <0,05). In fünfzehn Fällen kam es zur Schwangerschaft. Die Ergebnisse stehen im Einklang mit Erfahrungen anderer Institute. Prof. Viville und Dr. Wittemer konnten damit zeigen, dass ein hoher Anteil an abnormen Spermien sich negativ auf IVF-Erfolgsraten auswirkt. Dieser Einfluss der Spermienmorphologie auf die Befruchtungsrate bestätigt auch eindeutig das Potenzial der IMSI-Methode.

Screening, Selektion, Injektion

Das Straßburger Team setzt für IMSI-Behandlungen das hochauflösende, automatisierte Mikromanipulationssystem Leica AM6000-Big-S ein, mit dem sie die Spermien sowohl screenen, als auch selektieren und injizieren. Das System basiert auf dem vollautomatisierten inversen Forschungsmikroskop Leica DMI6000 B mit Vario-Zoom für stufenlose Vergrößerung bis 16 000x am Monitor. Über das Multifunktionspult können die Mediziner die elektrischen Manipulatoren sowie die wichtigsten Mikroskopfunktionen fernsteuern. Die y-off-Funktion bewegt die Manipulatoren nur noch in x-Richtung und erleichtert das Injizieren. Die z-Limit-Funktion stoppt die Bewegung nach unten und verhindert, dass Nadeln abbrechen. Das Leica AM6000 bietet mit dem 100xIMM-Objektiv einen vollautomatisierten differenziellen Interferenzkontrast (DIC).

Die bisherigen Erfahrungen mit IMSI stuft Dr. Wittemer als sehr vielversprechend ein. Mit IMSI lassen sich höhere Schwangerschaftsraten erzielen, die Zahl der Top-Embryonen ist höher als bei der klassischen Spermieninjektion und es kommt zu weniger spontanen Aborten. Am SIHCUS-CMCO wird die morphologisch selektierte Injektion eingesetzt, wenn konventionelle Methoden fehlschlagen. Bei ausgeprägter DNA-Fragmentation oder schwerer Teratozoospermie ist IMSI von vornherein das Verfahren der Wahl. Die Erfolge rechtfertigen in Dr. Wittemers Augen in jedem Fall den erhöhten Zeitaufwand für die Selektion, die mehr als zwei Stunden dauern kann, sowie die hohen Anforderungen an das optische System.

Weitere Studien erforderlich

Um dem steigenden Interesse an der IMSI-Methode zu begegnen, hat Leica Microsystems zusammen mit dem Centre Médico-Chirurgical in Frankreich eine Arbeitsgruppe initiiert, der inzwischen zehn Institute angehören. Neben regelmäßigem Erfahrungsaustausch planen die Beteiligten eine Multi-Center-Studie, um Zusammenhänge zwischen den morphologischen den und funktionellen Eigenschaften der Spermien, Befruchtungsquoten, Embryoentwicklung und Implantation weiter systematisch zu erforschen. Dadurch könnten Indikationen besser definiert und die Erfolgsraten weiter gesteigert werden. Weiterhin werden eine Bilddatenbank und ein ikonographischer Atlas zur Spermienmorphologie aufgebaut. Ein wichtiges Ziel besteht darin, detaillierte Selektionskriterien für ein standardisiertes Protokoll zu etablieren. Darüber hinaus wollen Prof. Viville und Dr. Wittemer weibliche Kriterien stärker berücksichtigen, denn auch IMSI kann mögliche maternale Faktoren nicht kompensieren.

* A. Schué, Leica Microsystems GmbH, 35578 Wetzlar

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