Neuartige Biopolymere helfen bei der Gentransfektion

Anbieter zum Thema

C3 Prozess- und Analysentechnik GmbH

TOSOH Bioscience GmbH

Philipps-Universität Marburg

Neues Polymer mit geringerer Zytotoxizität

Die RROP-Copolymerisation von 2-Methylen-1,3-dioxepan (MDO) mit DMAEMA führt zur erfolgreichen Synthese abbaubarer Polykationen mit PCL-Einheiten im Rückgrat [7]. Die Mikrostruktur konnte eindeutig durch 1D- und 2D-NMR-Analyse [Heteronucelar Multibond Correlation (HMBC) und Heteronuclear Multiple Quantum Correlation (HMQC)] nachgewiesen werden. Es wurde eine statistische Verteilung der Monomereinheiten im Copolymer gefunden. Die Zytotoxizität der neuen Polykationen ist ein wichtiger Parameter für die Anwendung in der Gentransfektion. Unabhängig von der Copolymerzusammensetzung wurden alle Polymere als nicht toxisch eingestuft und zeigten hohe Zellvitalität, womit sie als biokompatibel eingestuft werden können (s. Abb. 2).

Eine sehr gut etablierte Methode zur Evaluierung der Zytotoxizität und der Biokompatibilität ist die MTT-Analyse. MTT steht für ein Tetrazoliumsalz [3-(4,5,-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid] und kann zur Ermittlung der Lebendigkeit, des Wachstums und der Zytotoxizität bei Zellen eingesetzt werden. Die MTT-Analyse beruht auf der Reduktion von MTT durch die Mitochondrien lebender L929-Zellen (Standardzelllinie ISO 10993-5 und der US Pharmacopeia) zu einem wasserunlöslichen purpurnen Formazan, das spektroskopisch bestimmt wird.

Die Bindungseffizienz der Polymere mit Genen (z.B. DNS oder RNS) im Sinne einer Polyplexbildung ist für deren Stabilität wichtig. Die neuen Polyplexe wurden mit Hering-DNS als Modell-DNS und einer Copolymer-Lösung (BMDO-co-DMAEMA 12:88) hergestellt. Die Elektrophorese wurde mit 1% Agarosegel [(Ethidiumbromid in TAE (40 mM Tris/HCl, 1% Essigsäure, 1 m EDTA, pH 7,4)] durchgeführt. Es konnte so gezeigt werden, dass die Polyplexe auch bei niedrigen N/P-Verhältnissen von 1 sehr stabil waren (s. Abb. 3). Die hydrodynamischen Durchmesser der unverdünnten Polyplexe wurden mittels eines Zetasizers (Malvern Instruments) bei 25 °C bei einer Größenverteilung von 0,01-0,03 mit 102-117 nm bestimmt [6].

Abgesehen von den hier erwähnten neuen bioabbaubaren Copolymeren von DMAEMA wurden in der Vergangenheit von der Arbeitsgruppe Kissel eine Reihe nicht-viraler bioabbaubarer Vektoren systematisch untersucht. Dabei wurde u.a. der Einfluss des Molekulargewichts von PEI auf die Transfektionseffizienz und die Zytotoxizität zum ersten Mal beschrieben. Diesbezüglich wurden verschiedene Polymere als nichtvirale Gentransfektionsvektoren untersucht. Dazu zählen z.B. Polyethylenglykol(PEG)-(g)-PEI, Triblockcopolymer hochverzweigt(hy)-PEI-g-PCL-block(b)-PEG, aminmodifizierter PVA, Dendrimere und pDMAEMA-b-pHEMA-Blockcopolymere. Alle diese Polymere wurden als Polyplexe oder Nanopartikel hergestellt und nicht nur als DNS-Vektoren untersucht, sondern auch in vivo als siRNS- oder mRNS-Vektoren [8, 10]. Viele dieser Polymere basierten auf Block- oder Pfropfcopolymeren abbaubarer Polyester (PCL), die durch metallkatalysierte ROP hergestellt wurden. Hy-PEI-g-PCL-b-PEG ist ein Beispiel einer neuen Klasse amphiphiler bioabbaubarer Copolymere mit guter Biokompatibilität (geringer Zytotoxizität) und hoher Gentranskfektionsrate [11]. Die hydrolytische und enzymatische Abbaubarkeit der Polymere wurde ebenfalls untersucht. Die Hydrolyse der Polymere wurde in destilliertem Wasser und verschiedenen Pufferlösungen bei 37 °C ausgeführt. Der enzymatische Abbau wurde mit Lipase von Candida Antarctica bei 37 °C in 0,01 M Phosphatpuffer untersucht. In jedem Fall wurde der Abbau mit Gelpermeationschromatographie verfolgt, indem Änderungen der Molekulargewichte über die Zeit betrachtet wurden.

(ID:27354890)