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Probenvorbereitung in der Mikroskopie

Ohne langes Warten: Lösemittelfreie Schnelleindeckmittel

| Autor / Redakteur: Dusko Kadijevic* und Marcus Brückner** / Marc Platthaus

Abb.1a: Einbringen der mit Eukitt UV-beaufschlagten Präparate in einen UV-Ofen, vor und während der Belichtung mit UV-Licht.
Abb.1a: Einbringen der mit Eukitt UV-beaufschlagten Präparate in einen UV-Ofen, vor und während der Belichtung mit UV-Licht. (Bild: Orsatec)

Eindeckmittel werden in den Bereichen der Histologie, Immunologie und Zytochemie, benötigt, um biologische Proben für die Mikroskopie zu fixieren und für einen längeren Zeitraum haltbar zu machen. Weche Vorteile bringt ein lösemittelfreies Eindeckmittel?

Das so genannte Eindecken ist der letzte Schritt bei der Präparation für histologische Untersuchungen. Üblicherweise werden dabei Proben, z.B. Gewebe- oder Blutproben oder Zellen, zunächst auf einen Objektträger gebracht und dann mit einem Deckglas abgedeckt. Damit Objektträger und Deckglas sich nicht gegeneinander verschieben können, wird das Deckglas mit einem Eindeckmittel auf dem Objektträger fixiert. Dies verbessert zum einen die Handhabbarkeit. Zum anderen kann die fixierte Probe für viele Jahre aufbewahrt werden, ohne dass es zur Zersetzung kommt, da die Probe in das Eindeckmittel eingebettet ist und somit vor Feuchtigkeit, Sauerstoff und Lichteinwirkung geschützt wird.

Automatisierte Eindeckung von Präparaten

In der Anfangszeit wurden hier Eindeckmittel verwendet, die sehr lange Aushärtungszeiten benötigten, beispielsweise das transparente Baumharz Kanadabalsam [1].

Die Entwicklung von schnell aushärtenden Eindeckmitteln in den 50er Jahren des letzten Jahrhunderts hat es mit ermöglicht, dass sich die Bearbeitung von histologischen Proben zur Diagnose im medizinischen Bereich mittlerweile stark automatisiert und somit deutlich beschleunigt hat [2]. Hierzu werden heute so genannte Eindeckautomaten verwendet, die eine hohe Präzision und einen vielfach höheren Durchsatz generieren können, als das beim manuellen Eindecken möglich wäre. Auf diese Weise kann heute eine deutlich höhere Probenanzahl bearbeitet werden, als das in der Vergangenheit der Fall war, obwohl sich an der eigentlichen histologischen Technik in den letzten Jahrzehnten nicht viel geändert hat.

Eines der Gold-Standard-Eindeckmittel für das schnelle Fixieren ist Eukitt, das beispielhaft für ein Kunstharz-Xylol-basiertes Eindeckmittel steht. Bei den heutigen Standardsystemen beruht die Aushärtung auf dem eingesetzten Polymer, das im Lösemittel gelöst vorliegt und nach dem Verdunsten des Lösemittels beim Aushärten physikalisch erstarrt. Die Vorteile zu Kanadabalsam liegen in einer deutlich höheren Transparenz und der sehr hohen Aushärtungsgeschwindigkeit von ca. 20 Minuten. In den vergangenen Jahrzehnten haben sich sehr viele ähnliche Produkte im Markt etabliert. Sie werden heute in allen Bereichen der Histologie und Biologie verwendet. Xylol hat sich dabei als Lösemittel bewährt, da es für diese Anwendung sowohl hinsichtlich des Dampfdrucks als auch der Penetrationseigenschaften ins Gewebe ideal ist. Daneben gibt es Eindeckmittel auch auf Basis von Toluol und Petrolethermischungen, sowie das aus Schalen von Zitrusfrüchten gewonnene (R)-Limonen.

Mittlerweile wurden Xylol und seine Isomere in die so genannte CoRAP-Liste der ECHA aufgenommen, da es verdächtigt wird, sensibilisierend und als CMR-Stoff zu wirken [4]. Dies könnte mittelfristig dazu führen, dass Xylol und auch andere heute allgemein gebräuchliche organische Lösemittel zukünftig nicht mehr für alle Anwendungen eingesetzt werden dürfen. Da viele organische Lösemittel nicht nur gesundheitsschädlich oder umweltgefährdend sind, sondern auch brennbar, können sie mit Luftsauerstoff explosionsfähige Gemische bilden. Bei maschineller Verarbeitung müssen hier aufwändige Maßnahmen zum Explosionsschutz ergriffen werden.

Seit einigen Jahren gibt es auch Eindeckmittel auf Wasserbasis, die wasserlösliche Harz-Zusammensetzungen als Eindeckkomponente verwenden. Wässrige Eindeckmittel werden besonders für Präparate, bei denen ein Enzym oder Lipidnachweis durchgeführt wurde, verwendet, also Präparate, die nicht über eine aufsteigende Alkoholreihe entwässert wurden. Allerdings werden diese Produkte aufgrund der hohen Polarität von Wasser und der längeren Trocknungszeiten kaum in der Schnelleindecktechnik eingesetzt.

Einen großen Nachteil haben alle lösemittelbasierten Systeme: Durch das Verdunsten des Lösemittels verliert das System an Volumen – es kommt zu Schrumpf. Eine mögliche Folge ist Blasenbildung im Präparat. Gegebenenfalls ist das sehr aufwändig hergestellte Präparat (die Präparationsschritte können zwischen ein und fünf Tagen beanspruchen) ungeeignet für die mikroskopische Untersuchung. Es wird somit unbrauchbar [5].

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