Ohne Zerstörung messen – Chemisch optische Sensoren in der Bioreaktionstechnik

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Sofortige Erkennung von ungünstigen Bedingungen

Schüttelkolben werden vielseitig eingesetzt, unter anderem auch bei der industriellen Bioprozessentwicklung. Presens-Einwegsensoren werden in Erlenmeyer-Kolben angebracht, die dann mit dem Shake Flask Reader (SFR) ausgelesen werden. Mit diesem System können Sauerstoff und pH parallel in bis zu neun Schüttelkolben gleichzeitig überwacht werden. Dadurch lässt sich ein fortlaufender Einblick in die Sauerstoffversorgung und Stoffwechselaktivität der Kulturen gewinnen. Das SFR wird in einem herkömmlichen Schüttler montiert und ist mit fast allen Modellen kompatibel. Die Verbindung zu einem PC, mit dem die Messungen gesteuert und überwacht werden, wird drahtlos über einen Bluetooth-Adapter hergestellt.

Um das Betriebsverhalten des SFR, sowie Qualität und Reproduzierbarkeit der damit gemessenen Daten zu überprüfen, wurde E. coli DH5α in Glaskolben mit Schikanen und Plastikkolben ohne Schikanen kultiviert. Die Kolben waren alle mit einem Sauerstoffsensor, im Falle der Plastikkolben jeweils auch mit einem pH-Sensor versehen. Um die Reproduzierbarkeit der Messungen zu testen, wurden Schüttelkolben mit ähnlichem k_La für parallel durchgeführte Versuche verwendet (k_La ist ein spezifischer Koeffizient, der die Sauerstofftransferrate in einem bestimmten System quantifiziert). Jede Kultur wurde doppelt bei 37 °C und mit einer anfänglichen Schüttelfrequenz von 90 rpm angesetzt. Während der Anzucht in Glaskolben mit Schikanen wurde ein beschleunigter Abfall der Konzentration von gelöstem Sauerstoff festgestellt, wenn die Kultur mit einer optischen Dichte von 0,1 (OD 600 nm) angesetzt worden war. Um eine Sauerstofflimitierung zu vermeiden, wurde die Schüttelfrequenz schrittweise erhöht: von 90 auf 120 rpm nach 2 h, und von 120 auf 170 rpm nach 3,5 h. Die Kulturen zeigten während der ersten beiden Stunden offensichtliches, exponentielles Wachstum, während in der darauf folgenden Phase verschiedene Substrate im LB-Medium verbraucht wurden. Die Umstellung des zellulären Stoffwechsels konnte auch in deutlichen Anstiegen der DO-Kurve aufgezeichnet werden.

Nach insgesamt 5 h wurde die Schüttelfrequenz auf 120 rpm zurückgesetzt. Da die Respirationsaktivität der Kultur nach und nach abnahm, stieg der Gehalt an gelöstem Sauerstoff wieder langsam an. Das DO- und pH-Profil der Kulturen in Plastikschüttelkolben ohne Schikanen zeigte im Vergleich dazu signifikante Unterschiede. Die Sauerstoffzufuhr war eindeutig unzureichend. Schüttelkolben ohne Schikanen erwiesen sich für aerobe, schnell wachsende Kulturen wie E.coli als nicht geeignet.

Qualität der Prozesse in Bioreaktoren verbessern

Der Einsatz von chemisch optischen Überwachungsgeräten kann auch zur Qualitätsverbesserung und schnellen, reproduzierbaren Einführung von Prozessen in Bioreaktoren beitragen. Durchflusszellen mit Sensor werden über Luer-lock-Adapter in externe Schläuche integriert, oder Sensor Spots an transparente Bioreaktorwände angebracht; so können während des ganzen Prozesses nicht invasive Messungen durchgeführt werden.

Einen großen Vorteil bringt auch die zusätzliche Überwachung von Kohlendioxid in Bioreaktoren: zum Beispiel kann bei einem Anstieg des Kohlendioxid-Gehalts auf ein ungünstiges Niveau rechtzeitig reagiert, und Sauerstoff in den Headspace der Probe eingeleitet werden. Experimente, in denen chemisch optische Messgeräte mit herkömmlichen elektrochemischen Systemen verglichen wurden, sollten die Effizienz der chemisch optischen Sensoren bei Anwendung in Bioreaktoren prüfen. Über drei Wochen wurden Konzentration von gelöstem Sauerstoff und Kohlendioxid in CHO-Zellkulturen gemessen. Die mit den optischen Sensoren aufgezeichneten Werte zeigten einen sehr ähnlichen Verlauf zu den Messungen der elektrochemischen Standardsonde. Die Empfindlichkeit des chemisch optischen Systems ist bei diesem Versuch eindeutig höher als die der herkömmlichen Messgeräte.

Fazit: Optosensorik bringt Vorteile

Die optosensorischen Systeme von Presens ermöglichen schnelle und präzise Messungen von DO, pH und CO₂. Kritische Situationen, wie etwa der Rückgang des Sauerstoffgehalts, schädliche pH-Werte oder ungünstige CO₂-Konzentrationen in Bioreaktoren können festgestellt und geeignete Gegenmaßnahmen ergriffen werden.

Der Einsatz von Einwegsensoren ermöglicht es, diese wichtigen Kulturparameter einfach und nicht invasiv über die ganze Kette eines biotechnologischen Entwicklungsprozesses zu überwachen – vom ml- Maßstab in der Forschung bis zum Bioreaktor in der Produktion. Diese Technologie kann erheblich dazu beitragen, die Reproduzierbarkeit und Qualität von Kulturen zu verbessern und darüber hinaus in einer Vielzahl von Forschungsvorhaben Anwendung finden.

Referenzen:

[1] Scheider et al.:Optical device for parallel online measurement of dissolved oxygen and pH in shake flask cultures, Bioprocess Biosyst. Eng. 2009

[2] Naciri, et al.: Monitoring pH and dissolved oxygen in mammalian cell culture using optical sensors, Cytotechnology 2010

[3] Baggio, et al.: Physical-Chemical Sensors: Application to Bioreactor Monitoring and Control, ESACT 2009, Dublin, Ireland

[4] Patent DLR Nr. EP 1000345 (B1) und Nr. US 6602716 (B1)

* Dr. S. Arain: PreSens Precision Sensing GmbH, 93053 Regensburg

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