Chemisch optische Sensoren Ohne Zerstörung messen – Chemisch optische Sensoren in der Bioreaktionstechnik

Geeignete Zelllinien für die Proteinexpression zu überprüfen oder auch den Scale-Up von Bioprozessen zu entwickeln, erfordert optimale Kulturbedingungen. Mit einer chemisch optischen Sensortechnologie werden die wichtigen Kulturparameter pH, Sauerstoff und CO₂ nicht invasiv überwacht.

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PreSens - Precision Sensing GmbH

Vor allem in kleinen Kulturformaten (Schüttelkolben, Mikrotiterplatten) kann die Überwachung von gelösten Sauerstoffkonzentrationen (DO) und pH-Werten mit herkömmlichen Messsystemen erheblichen Aufwand verursachen. Problematisch ist auch der Einsatz von invasiven Messmethoden (z.B. Elektroden) in kontaminationsfreien Prozessen. Unter Verwendung von chemisch optischen Sensoren können diese Kulturparameter nicht invasiv gemessen werden. So genannte Sensor Spots werden im Inneren von Einwegbehältern angebracht und können mit entsprechenden Messgeräten durch die transparente Behälterwand ausgelesen werden. Durch die Integration dieser Sensoren in den Produktionsprozess der Einwegbehälter kann ihre Sterilität garantiert werden. Die richtige Auswahl der Ausgangsstoffe gewährleistet ihre nicht-toxischen Eigenschaften. Durch bereits vorkalibrierte Systeme kann ein Maximum an Effizienz erzielt werden.

Sauerstoff, Kohlendioxid und pH bestimmen

Die chemisch optischen Sensoren von Presens bestehen aus einer dünnen Schicht von sensitivem Material, das auf pH, Sauerstoff oder CO₂ reagiert. Bei der Sauerstoffmessung werden die Sensor-Spots durch Licht einer bestimmten Wellenlänge angeregt und emittieren daraufhin Fluoreszenzlicht. Sind Moleküle des entsprechenden Analyten anwesend, wird die freigesetzte Energie in einem strahlungslosen Vorgang auf das entsprechende Molekül übertragen, wodurch das Fluoreszenzsignal abgeschwächt oder gelöscht wird. Im Falle von pH- und CO₂-Detektion wird eine Kombination verschiedener fluoreszierender Farbstoffe für „Dual Lifetime Referencing DLR“ eingesetzt, einem patentierten, intern referenzierten Messprinzip. Das entsprechende Auslesegerät enthält ein optisches Modul mit LEDs und Photodioden. Mithilfe eines Kunststofflichtwellenleiters wird das Licht zum Sensor geleitet und das Fluoreszenzsignal ausgelesen.

Mikrotiterplatten werden häufig eingesetzt um den Durchsatz zu erhöhen und gleichzeitig das Probevolumen zu reduzieren. Mit den Einweg-Sensor-Platten von Presens können Sauerstoff und pH in Echtzeit überwacht werden, ohne Kontaminationsrisiko für die Kultur. In den Multidishes, die im 24- oder 6-Well-Format erhältlich sind, ist entweder ein Sensor für Sauerstoff (Oxodish) oder pH (Hydrodish) am Boden einer jeden Well angebracht. Die Platte wird mit den Proben gefüllt und auf dem Sensor Dish Reader (SDR) platziert, der die Sensoren nicht-invasiv durch den Plattenboden ausliest. Das kleine und robuste Gerät kann in Inkubatoren und Schüttlern benutzt werden.

Optimierung der Startzelldichte von Kulturen

Eine typische Anwendung des SDR ist die Kultivierung von CHO-Zellen, die häufig in der biotechnologischen Produktion eingesetzt werden. In den beschriebenen Versuchen wurden zwei SDRs miteinander verbunden, um parallel Messungen mit Sauerstoff- und pH-Sensoren durchzuführen. Die Zelllinie wurde an Suspensionkultur angepasst und über zwölf Tage mit einem Probenvolumen von 1,2 ml pro Well inkubiert. Es wurden vier verschiedene Zellkonzentrationen (Zellen/ml: 50, 2 x 10³, 2,5 x 10⁴, und 3,2 x 10⁵) parallel getestet um festzustellen, wie empfindlich das Gerät hinsichtlich seines Detektionslimits in Bezug auf Zellzahlen je Probe ist. Der Sauerstoffverbrauch war direkt von Zellkonzentration und Stoffwechselstatus der Kultur abhängig (s. Abb. 3). Die Proben mit der höchsten Zellkonzentration zeigten innerhalb einiger Stunden einen Abfall des Sauerstoffgehalts auf nur etwa 9% Luftsättigung. Dieser drastische Vorgang wiederholte sich nach jedem Wechsel des Kulturmediums. Nach etwa fünf Tagen war der Sauerstoffgehalt auf ein Minimum gefallen, wogegen ab Tag zehn wieder ein leichter Anstieg der Sauerstoffkonzentration im Medium festgestellt werden konnte. Das versehentliche Entfernen von Zellen aus der Kultur, was bei Suspensionskulturen durchaus passieren kann, war vermutlich für die Abweichung nach jedem Austausch des Kulturmediums verantwortlich. Proben mit geringerer Zelldichte zeigten eine ähnliche Kinetik nur mit entsprechender Verzögerung. Mikroskopische Analysen ließen erkennen, dass sich in den Proben mit den beiden höheren Zelldichten nach längerer Zeit Zellaggregate formten. Das kann die Sauerstoffkinetik beeinflussen: Zellkomplexe können sich beim Wechsel des Mediums lösen und die Aggregatstruktur den Zellstoffwechsel zunehmend behindern. Dies war vermutlich der Grund für den Sauerstoffanstieg bis zu einem Gehalt von etwa 15% Luftsättigung ab Tag zehn.

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