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EXTRAKTION & FILTRATION Probenvorbereitung im Pharmabereich - eine differenzierte Betrachtung

Autor / Redakteur: KEES ENSING* / Gerd Kielburger

Wissenschaftler in der Pharmazeutischen Industrie sind ständig auf der Suche nach neuen Ansätzen, die die Methodenentwicklung und Routineanalyse beschleunigen. In diesem Zusammenhang stellt die LC-MSTechnologie mit ihrer Sensitivität und Selektivität die Trennund Detektionsmethode der Wahl dar.

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Wissenschaftler in der Pharmazeutischen Industrie sind ständig auf der Suche nach neuen Ansätzen, die die Methodenentwicklung und Routineanalyse beschleunigen. In diesem Zusammenhang stellt die LC-MSTechnologie mit ihrer Sensitivität und Selektivität die Trennund Detektionsmethode der Wahl dar. Je höher die Anforderung an die Sensitivität und/oder Genauigkeit und Präzision, desto höher sind auch die Anforderungen an die Probenvorbereitung zu stellen.

Der Ruf nach einer allgemein gültigen Lösung im Bereich der Probenvorbereitung ist laut, allerdings kann die Anwendbarkeit einer solchen allgemeinen Methode auf die interessierende Substanz nicht vorhergesagt werden. In diesem Artikel soll der Versuch unternommen werden, unterschiedliche Probenvorbereitungsmethoden für unterschiedliche Anwendungen zu evaluieren [1-5]. In der letzten Zeit hat in der Pharmazeutischen Industrie die Anzahl der Substanzen dramatisch zugenommen, die als potentielle Kandidaten weiter untersucht werden. Beginnend mit der Kandidatensuche werden in der Regel über 1000 neue Substanzen pro Tag Liganden-Bindungstests oder Funktionsassay zugeführt.

In der Folge werden bei einer Anzahl selektierter Substanzen Strukturmodifikationen basierend auf den Funktionsstudien durchgeführt, um die gewünschten Eigenschaften zu verstärken.Dies führt zu näherungsweise 2-5 Substanzen pro Tag, für die ein bioanalytischer Assay zur Analyse des in-vitro-Metabolismus und 1-2 Substanzen pro Tag, für die ein bioanalytischer Assay für die in-vivo-Metabolismus Studien entwickelt wird. Diese Studien sind gekennzeichnet durch eine niedrige Probenanzahl (20-100) und kurzen Report-Zeiten (2-10 Tagen). In Anbetracht der Analytenkonzentration von >100 nM ist die Methodenentwicklung einfach und schnell (0,5-5 Stunden) mit geringer Wichtigkeit im Hinblick auf die Probenvorbereitung.

Substanzen, die aus dieser Phase heraus selektiert werden, kommen in die Klinische Phase I-III. Dabei werden 20 bis 50 Substanzen pro Jahr in der Phase I gestestet (1000 Proben/Substanz). Zwischen 10 und 30 Substanzen erreichen die klinische Phase II mit ebenfalls 1000 Proben/Jahr. Fünf bis zehn Substanzen werden die Phase III erreichen, in der Probenanzahlen bis 50000/Substanz bis zur Registrierung anfallen können. Die Konzentration der Substanzen in dieser Phase liegt in der Regel zwischen 10 pM und 10 nM und sind damit 100-1000 mal niedriger als in den präklinischen Untersuchungen. Dies hat zwangläufig Einfluss auf die Probenvorbereitung und den Probendurchsatz und erhöht ebenso die notwendigen Zeiten für die Methodenentwicklung.

Deproteinisierung

Die Abtrennung von Proteinen aus der Probenmatrix ist für in-vitro Assays weniger von Bedeutung im Vergleich zu in-vivo Tier- und Humanstudien. Dies liegt an der relativ geringen Protein- und der hohen Analytenkonzentration. Für in-vivo Proben können die Proteine durch Ultrafiltration eliminiert werden, wobei die niedermolekulare Zusammensetzung der Probe intakt bleibt. Die Bindung des Analyten an Proteine und/oder Membranen kann dabei die Bestimmung stark beeinflussen.

Ein anderer Ansatz zur Deproteinisierung ist die Proteinpräzipitation, die durch den Zusatz chaotroper Agentien (anorganisch und organisch) ausgelöst wird. Das Präzipitat wird nachfolgend durch Filtration bzw. Zentrifugation abgetrennt. Die so behandelte Probe liegt nun verdünnt vor und ist nicht immer kompatibel zum Analysensystem.

Extraktions-Methoden

Ein höherer Reinigungsgrad kann mit der Extraktion des Analyten aus der Probenmatrix erreicht werden. In diesem Zusammenhang ist die Flüssig-Flüssig-Extraktion immer noch eine hoch effiziente Methode zur Beseitigung von Proteinen und Salzen. Leider ist die Konzentration des Analyten in der Extraktionslösung geringer als in der Probe und zudem ist diese Lösung inkompatibel mit dem Analysen-System. Dies hat notwendigerweise das Eindampfen und Wiederaufnehmen der Probe für die weiteren Analysengänge zur Folge.

Die verbreiteste Methode im Bereich der Festphasenextraktion (SPE) ist die Offline -Methode unter Verbrauch einzelner SPE-Säulen oder 96-Positionen Mikrotiterplatten mit manueller oder automatisierter Durchführung der Extraktion.[1] Die bei dieser Methode erhaltenen Extrakte können entweder direkt analysiert oder aber eingedampft und in einem kompatiblen Lösungsmittel wieder aufgenommen werden. Da für jede Probe eine neue Extraktionssäule benutzt wird, reduzieren sich Verschleppungsphänomene auf den Dispensions- und Injektionsteil des benutzten Analysensystems. Die Methodenentwicklung dieser Offline-Variante ist im Vergleich zur Online-Methode wesentlich zeitaufwendiger.

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Im Bereich der Online-Festphasenextraktion existieren mehrere Ansätze. Der Einfachste besteht in der Verwendung einer Extraktionsäule in der Art einer Vorsäule, auf der die Probe zurückgehalten wird. Während die Waschlösung dem Abfall zugeführt wird, erfolgt die Elution auf die Hauptsäule. Die Verschmutzung der Extraktionssäule durch Matrixkomponenten und Verschleppung von Proben sind die hauptsächlichen Schwächen dieses Aufbaus. Der Gebrauch moderner/modifizierter Sorbentien (Restricted Access Medien: hydrophile Oberfläche, hydrophobe Porenoberfläche) reduzieren die Absorption von Proteinen über 15 kD und verlängern die Haltbarkeit dieser Extraktionssäulen. Kumulative Injektionen bis zu 100 mL Serum auf eine einzige Säule sind so möglich (Boos, K.-S. persönliche Mitteilung). Neben der Verschmutzung mit niedermolekularen Bestandteilen und der Verschleppung sind vor allem die langen Analysenzeiten erwähnenswert (10-20 min).

Ein anderer Online-Ansatz ist die Turbulent-Flow-Chromatographie. Obgleich die Turbulenz innerhalb der Flüssigkeit durch die Anwesenheit von Partikeln entsteht (Eddy-Diffusion), ist der Fluss nicht wirklich turbulent. [2,3] Die Extraktionssäulen haben unterschiedliche Dimensionen (50 mm und 1 mm I.D.) und enthalten große Partikel (50 µm). Durch die hohe Geschwindigkeit der mobilen Phase wird die Adsorption großer Moleküle stark behindert. In einigen Fällen kann die Extraktionssäule ebenso als analytische Säule benutzt werden, wenn der Analyt in einem schmalen Band retardiert wird. Es muss allerdings erwähnt werden, dass aufgrund der großen Partikel die Trennleistung der Extraktionssäule mäßig ist (geringe Trennbodenzahl bedingen breite Peaks und nachfolgend schlechte Auflösung und schlechtere Bestimmungsgrenzen). Die Elution von der Extraktionssäule auf eine nachfolgende, geeignete analytische Säule stellt eine Alternative dar, wenn eine höhere Trennleistung gefordert ist. Die Verschmutzung der Extraktionssäule durch nieder-molekulare Komponenten sowie die Probenverschleppung sind aber weiterhin kritische Punkte.

Die Online-Festphasenextraktion mit Einmalkartuschen ist sicherlich der ausgereifteste Ansatz. [4,5] Diese Methode eliminiert die Probleme mit der Verschmutzung durch Matrixkomponenten sowie die Verschleppung bedingt durch die gleiche Extraktionssäule. Gleichzeitig weist dieses System aber die gleiche Analysengeschwindigkeit wie die Tubulent-Flow Methode auf. Der Extraktionsprozess mittels des Prospekt/Symbiosis-Systems wird in Graphik 1 dargestellt. In der Tabelle 1 werden die bisher beschriebenen Methoden der Probenaufarbeitung zusammengefasst.

Strategische Überlegungen

Es ist nicht Absicht dieses Manuskriptes, die Kosten für die aufgezeigten Methoden für individuelle Assays, der klinischen Studie oder der Erarbeitung von Registrierungsunterlagen gegenüberzustellen. Tatsache ist, dass diese im Vergleich zur Verschiebung einer Markteinführung durch Wahl eines nicht geeigneten Analysenverfahrens vernachlässigbar sind. Immer nur retrospektiv wird sich ermitteln lassen, ob der gewählte Ansatz auch der ökonomische war. Trotzdem kann die Gefahr des Versagens eines gewählten Assays durch eine adäquate Probenvorbereitung, insbesondere für GLP-konforme Assays, während klinischer Studien minimiert werden.

Die Analyse von Proben aus einer großen Anzahl von Individuen mit ihrem differenzierten Metabolismus, den Differenzen im Bereich des Ernährungsverhaltens und der möglichen Einnahme weiterer Medikamente (therapeutisch wie auch ergänzende) impliziert die Gefahr von Interferenzen von bekannten wie auch unbekannten Komponenten mit dem Analyten. Durch die Benutzung des Massenspektrometers mit seiner Selektivität bei der Bestimmung kann die Wahrscheinlichkeit der Überlappung mit Matrixbestandteilen mit dem Analyten minimiert werden, nicht jedoch die mögliche Beeinflussung bei der Ionisation des Analyten. Die amerikanische Regulierungsbehörde FDA hat die potentielle Gefahr der matrixbedingten Suppression der Ionisation des Analyten erkannt und verlangt bereits weitergehende Untersuchungen bei der Validierung der massenspektrometer-basierenden Analysenmethoden [6].

Die Neuentwicklung von Analysenmethoden während einer klinischen Studie sollte vermieden werden, da sie weitergehende Kreuz-Validierungen und Neu-Analyse bereits erhobener Daten nach sich zieht. Eine ausgereifte Probenvorbereitung wird dieses Risiko minimieren. Durch den mehr qualitativen Charakter der generierten Daten in nicht-klinischen Studien wird die Matrix-Suppression weniger problematisch sein. Nicht-SPE und Offline-SPE Probenvorbereitungsmethoden sind zeitaufwendiger, können aber vom normalen Laboranten durchgeführt werden. Die Online-SPE weist eine maximale Automatisierung aus, benötigt aber gut ausgebildetes Laborpersonal für die Methodenentwicklung. Die Routineanalytik stellt bereits ein voll automatisierter Prozess dar.

Zusammenfassung

Es existieren verschiedenste Strategien der Probenvorbereitung, die alle ihre Stärken und Schwächen haben, allerdings gibt es keine allgemein gültige die auf jeden Analyten trifft. Je höher die Komplexität der Probenzusammensetzung (niedrige Analytenkonzentration in einer Matrix mit hohem Anteil weiterer Komponenten unterschiedlicher Zusammensetzung), desto höher sind die Anforderungen an die Probenvorbereitung.

In nicht-klinischen Studien können alle aufgezeigten Methoden funktionieren, in klinischen Studien sollte die ausgereifteste Methode gewählt werden. Die Entscheidung zwischen der Offline-SPE und der Online-SPE ist strategischer Natur dahingehend, ob in Personal oder in Hardware investiert wird. Die Online-SPE eröffnet dabei die Möglichkeit der automatisierten Methodenentwicklung.

Literatur[1] Hopfgartner, G., E. Bourgogne: Mass Spectrom. Reviews 22, 195-214 (2003).[2] Zimmer, D., V. Pickard, W. Czembor, C. Müller: J. Chromatography A 854, 23-35 (1999).[3] Hermann, J.L.: Rapid Commun. Mass Spectrom. 16, 421-426 (2002).[4] Bruins, C.H.P., C.M. Jeronimus-Stratingh, K. Ensing, W.D. van Dongen, G.J. de Jong: J. Chromatography A 863, 115-122 (1999).[5] Jermal, M., Y. Quing, D.B. Whigan: Rapid Commun. Mass Spectrom. 12, 1389-1399 (1998).[6] Food and Drug Administration: Guidance for industry (May 2001).

* Dr. K. Ensing, Elimo BV, freiberuflicher Berater für Firmen im Bereich der Life-Science Technologie, 9983 PA Roodeschool, Niederlande

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