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Molekulardiagnostik

Schnelle Endpunktdetektion für die PCR

| Autor/ Redakteur: Melanie Trenkmann*, Timo Hillebrand* ?und Alexander Berka* / Marc Platthaus

Nachweismethoden zur Molekulardiagnostik sind zeitkritische Faktoren und ein Hindernis im allgemeinen Trend, möglichst schnell zu einem aussagekräftigen Ergebnis zu gelangen. Hier bietet die Business-Unit bio solutions von Analytik Jena eine Produktkombination an, die den Nachweis von z.B. Salmonellen in deutlich kürzerer Zeit ermöglicht. Sie besteht aus einem patentierten Verfahren zur DNA/RNA-Aufreinigung, dem Rapid-Thermalcycler für die PCR und einem Fluoreszenzreader.

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Abb. 1 Beschleunigt die Molekulardiagnostik: Speedscan, der PCR-Endpunktdetektor im Plattenreaderformat, ermöglicht die Auswertung bzw. Fluoreszenzmessung in jedem Well einer vollständig belegten 96er-Mikroplatte in 50 Sekunden.
Abb. 1 Beschleunigt die Molekulardiagnostik: Speedscan, der PCR-Endpunktdetektor im Plattenreaderformat, ermöglicht die Auswertung bzw. Fluoreszenzmessung in jedem Well einer vollständig belegten 96er-Mikroplatte in 50 Sekunden.
( Archiv: Vogel Business Media )

Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) gehört zu den absoluten Schlüsseltechnologien der modernen biologischen Forschung und der molekularen Diagnostik. Sie ist aus keinem biologischen Labor mehr wegzudenken. Mit der zunehmenden Anwendung der PCR in der täglichen Routine wächst auch der apparative Anspruch an das PCR-Laboratorium, um jederzeit zuverlässige Analysen zu garantieren.

Es muss nicht immer Real-Time-PCR sein

Der Speedscan (s. Abb. 1) ist ein Fluoreszenzreader, der speziell zur einfachen Bestimmung von PCR-Produkten konzipiert wurde. Nach erfolgter Amplifikation des Targets, kann eine direkte qualitative Auswertung ohne Öffnen der Reaktionsgefäße mittels Fluoreszenzdetektion erfolgen. Das Risiko einer möglichen Kontamination ist damit stark minimiert. Im diagnostischen Einsatz reichen vielfach einfache Ja/Nein-Aussagen aus, wenn es z.B. darum geht, die bloße Präsenz eines Mikroorganismus (Bakterium, Virus) in einer klinischen Probe als Nachweis für eine Infektion zu zeigen. Für solche Fragestellungen findet der Speedscan Anwendung. Das System stellt so eine Alternative zu oftmals teuren Real-Time-PCR-Systemen dar. Der Speedscan eignet sich auch ideal zur Erweiterung schon vorhandener Thermocycler.

Hohe Geschwindigkeiten und Flexibilität der PCR

Die PCR-Endpunktdetektion bietet weitere wesentliche Vorteile. Mit der Einführung sogenannter rapid-Thermalcycler, wie dem Speedcycler (s. Abb. 2), können typische Amplifikationen in 8 bis 30 Minuten durchgeführt werden.

Echte rapid-PCR beruht dabei nicht auf chemischen Additiven oder speziellen Enzymmixen, sondern ist auf die tatsächliche hohe Geschwindigkeit des Gerätesystems zurückzuführen. Darüber hinaus kommen zusätzlich chemische Modifikationen zur Anwendung, womit die Gesamtleistung der rapid-PCR wiederum gesteigert wird.

Die traditionelle Gelelektrophorese mit einer Laufzeit von 30 bis 45 Minuten zuzüglich Präparation, wird somit zum zeitlichen Hemmnis. Hingegen ist das Auslesen einer 96er-PCR-Platte mittels Fluoreszenzmessung bereits nach wenigen Sekunden pro Farbkanal abgeschlossen. Der Speed-scan kann bis zu vier verschiedene Fluoreszenzfilter aufnehmen und ist so bestens für Multiplexanwendungen geeignet. Resultierend aus den vier fixen Extinktionswellenlängen (Anregung) (s. Abb. 4) zwischen 470 und 636 nm und den vier zugeordneten Emissionswellenlängen (Messsignale) (s. Abb. 4) zwischen 526 und 633 nm, ergibt sich ein breites Spektrum an Anwendungen. Alle typischen derzeit im Markt erhältlichen Fluorophore können zur Fluoreszenzmessung herangezogen werden, womit die Funktion des Readers über die Endpunktdetektion von PCR-Produkten hinausgeht.

Endpunktdetektion humanpathogener Salmonellen

Um die Schnelligkeit, Effektivität und Spezifität der Produktkombination zu verdeutlichen, soll beispielhaft die Detektion humanpathogener Salmonellen aus Nahrungsmitteln genannt werden. Die jüngste Salmonellenepidemie Ende April 2007, bei der sich rund 270 Patienten und Mitarbeiter des Klinikums Fulda infizierten [1], verdeutlicht, wie wichtig schnelle und effektive Nachweismethoden im Lebensmittel-Diagnostik-Sektor sind. Eine auf dem Speedcycler etablierte PCR-Routine und die darauffolgende Fluoreszenzauswertung mittels Speedscan, erlaubt eine selektive und effiziente Salmonella-Detektion bei gleichzeitig stark reduziertem Zeitaufwand.

Durchführung und Auswertung des Salmonellen-Nachweises per PCR

Die Salmonella-Bakterien-DNA wurde zunächst durch ein neuartiges, patentiertes und erheblich beschleunigtes Aufreinigungsverfahren isoliert. Nach etwa 30 bis 40 Minuten konnte somit die DNA als Ausgangsmaterial im PCR-Master-Mix eingesetzt werden.

Die Voraussetzung für den spezifischen Salmonellen-Nachweis erfolgte dann durch eine 40-Zyklen-PCR auf dem Speedcycler in rund 35 Minuten, wobei ein Salmonella-enterica-spezifischer Teil des Invasion-Protein-Gens (Inv A) amplifiziert wurde. Die optisch gesealte Speedcycler-Mikroplatte wurde anschließend ohne eine weitere Behandlung im Speedscan in rund 50 Sekunden fluoreszenzvermessen.

Der vollständige Salmonella-Nachweis konnte unter Anwendung dieser neuen Technologie in weniger als 1,25 Stunden abgeschlossen werden. Die in Abbildung 5 dargestellten Messergebnisse verdeutlichen die hohe Spezifität der Detektionsmethode.

Neben Salmonella enterica konnte auch der Subtyp Salmonella typhimurium eindeutig nachgewiesen werden, wobei die für den Salmonellennachweis unerwünschten Querempfindlichkeiten anderer in Lebensmitteln vorkommender Bakterien, wie E.coli oder verschiedene Enterobacter, ausgeschlossen wurden (s. Abb. 5).

Hintergrund: Was sind Salmonellen?

Vor allem in den Sommermonaten mit zunehmenden Festen und Freizeitaktivitäten in Verbindung mit verderblichen Nahrungsmitteln, werden bei Durchfallerkrankungen vermehrt Salmonellen (s. Abb. 3) isoliert [2]. Es handelt sich hierbei um gram-negative, bewegliche Stäbchenbakterien aus der Familie der Enterobacteriaceae [2–7], die mit der Gattung Escherichia eng verwandt sind [5] und Magen-Darmerkrankungen [3] (Salmonellose oder Salmonellen-Enteritis) verursachen können. Die derzeit gültige Nomenklatur unterteilt die Salmonellen in nur zwei Spezies: S. enterica und S. bongori [5]. Von besonderer epidemiologischer Bedeutung ist die Spezies S. enterica, die in sechs Subspezies und rund 2300 bis 2500 Serovaren vorkommt. In Deutschland werden die meisten Salmonellosen durch die Serovare S. enteritidis und S. typhimurium verursacht [2–7].

Literatur

[1] http://www.aerztezeitung.de/docs/2007/05/31/099a0503.asp?cat=/news[19.06.2007]

[2] http://www.medizin.de/gesundheit/deutsch/696.htm [19.06.2007]

[3] http://www.invitrobiotec.de/salmonellen.htm [19.06.2007]

[4] http://www.aok.de/bund/tools/mediity/diagnose.php?icd=12 [19.06.2007]

[5] http://de.wikipedia.org/wiki/Salmonellen [19.06.2007]

[6] http://www.rki.de/cln_048/nn_196658/DE/Content/Infekt/EpidBull/Merkblaetter/Mbl__Salmonellose.html [19.06.2007]

[7] http://www.animal-health-online.de/drms/klein/salmonella.htm [19.06.2007]

[8] Including the majority of S. enterica serovars. (Journal of Clinical Microbiology, July 2000, p. 2465-2467

*M. Trenkmann, T. Hillebrand* und A. Berka*, Analytik Jena AG, Business-Unit bio solutions, 07745 Jena

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