Probenpräparation Schnellere Krankheitsdiagnose durch automatisierte Probenpräparation

Fortschreitende Globalisierung und Effekte wie der Klimawandel begünstigen die Ausbreitung von Infektionskrankheiten. Um die Gefahr von Epidemien zu verringern, wird am Veterinäruntersuchungsamt Rhein-Ruhr-Wupper eine automatisierte Probenpräparation eingesetzt. Diese ermöglicht im Falle eines Krankheitsausbruchs die schnelle Aufarbeitung eines großen Probenaufkommens.

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Infektionskrankheiten bei Nutztieren führen allein in Deutschland jährlich zu wirtschaftlichen Verlusten in Milliardenhöhe. Deren Ausbreitung wird durch eine fortschreitende Globalisierung unterstützt. Doch auch Phänomene wie der Klimawandel begünstigen das Auftreten bestimmter Krankheiten in einigen Regionen Europas. So trat die Blauzungenkrankheit (s. Kasten Hintergrund) im Jahr 2006 erstmals in Nordeuropa auf. Wissenschaftler führen dies auf die fortschreitende globale Erwärmung zurück.

Das Chemische und Veterinäruntersuchungsamt Rhein-Ruhr-Wupper (CVUA-RRW) in Krefeld spielt bei der Überwachung und Diagnose einer Vielzahl von Infektionskrankheiten bei Nutztieren eine entscheidende Rolle. In der staatlichen Institution werden jeden Tag eingereichte Proben verarbeitet – Anzahl und Art sind dabei nie vorhersehbar.

Zur Überwachung von Infektionskrankheiten bei Nutztieren setzt das CVUA-RRW eine Anzahl von Veterinärdiagnosetests ein. Die Abteilungen Pathologie, Serologie, Bakteriologie, Virologie und Molekularbiologie des Instituts führen Screenings für eine Vielfalt von Tierkrankheiten, einschließlich Viruserkrankungen wie der Blauzungenkrankheit, der Vogelgrippe und der klassischen Schweinepest durch. Für die Bearbeitung und Untersuchung der Proben werden automatisierte Verfahren eingesetzt. Auch zur Überwachung des jüngsten Ausbruchs der Blauzungenkrankheit in Nordeuropa setzte die Molekularbiologie-Abteilung des Instituts eine automatisierte Probenpräparationsplattform ein.

In der Vergangenheit erfolgten sowohl die ELISA-Untersuchungen in der Serologie-Abteilung als auch die Nukleinsäureextraktionen und PCR-gestützten Untersuchungen in der Molekularbiologie-Abteilung im Rahmen manueller Verfahren. Diese sind jedoch in der Regel zeitaufwändiger als automatisierte Methoden. Zudem sind sie umständlich und erreichen bei einer Erhöhung der Probenzahl schnell ihre Grenzen. Ein Hauptproblem, mit dem das Institut ständig konfrontiert wird, ist die unvorhersehbare Anzahl und Art von Proben, die täglich eingereicht werden. Das Labor muss schnell auf plötzliche Krankheitsausbrüche reagieren und unabhängig vom Probenaufkommen rechtzeitig Testergebnisse liefern können. Die Testverfahren müssen außerdem gleichbleibend und zuverlässig sein. Eine manuelle Bearbeitung lässt hier Spielraum für menschliche Fehler.

Automatisierte Variante bietet Vorteile

Um diesen Anforderungen zu genügen, wurde in der Molekularbiologie-Abteilung des Instituts eine automatisierte Probenpräparationsplattform installiert, mit der virale RNA der Tierproben extrahiert wird. Die Plattform basiert auf dem Pipettierroboter von Tecan Freedom EVO 150. Diese wurde aufgrund ihrer Flexibilität, Geschwindigkeit und Zuverlässigkeit ausgewählt. Zudem lässt sich die Arbeitsstation an die Untersuchung einer Vielzahl von Viren anpassen. Die täglichen Anforderungen an Probendurchsatz werden dabei problemlos erfüllt. Das System wird derzeit für den Nachweis des Blauzungen-, Vogelgrippe- und des klassischen Schweinpestvirus eingesetzt. Es ist darüber hinaus auf RNA-Präparationen anderer Viren übertragbar und mit einer Vielzahl verschiedener Probengefäße wie Eppendorf-Röhrchen, Deep-Well-Platten und Blutröhrchen kompatibel.

Präparation viraler RNA für Blauzungenuntersuchungen

Proben, die auf das Blauzungenvirus getestet werden sollen, kommen beim CVUA-RRW gewöhnlich in Form von Vollblut-EDTA-Proben an, die mit Barcodes markiert in das Laborinformationssystem (LIS) der Serologie-Abteilung eingegeben werden. Die Serologie-Abteilung führt mit ihrem eigenen automatisierten Tecan ELISA-Prozessor an allen Proben ELISA-Untersuchungen durch, um virale Antikörper nachzuweisen und den Virus-Serotyp zu bestimmen. Weitere Aliquots jeder Probe werden in Deep-Well-Platten verteilt und zur Molekularbiologie-Abteilung geschickt. Hier findet eine automatisierte RNA-Isolation, Reinigung und Analyse mit einem Verfahren statt. Das Verfahren beruht auf Protokollen, die im nationalen Referenzlabor (Friedrich-Löffler-Institut auf der Insel Riems) verwendet werden, das ebenfalls mit einem Pipettierroboter von Tecan ausgestattet ist. Virale RNA wird in 96-Well-Platten präpariert, sodass 86 zu testende Proben sowie negative und positive Kontrollen möglich sind. Jede elfte Probe dient als interne negative Kontrolle für eine Prüfung auf Kreuzkontaminationen. Die Verarbeitung der gesamten 96-Well-Platte dauert mit der automatisierten Plattform zwei Stunden und 15 Minuten. RNA-Präparate werden anschließend sofort zur reversen Transkription und qualitativen Echtzeit-PCR für den Nachweis des spezifischen RNA-Segments des Blauzungenvirus verwendet.

Echtzeit-PCR verringert Ausbreitung von Infektionskrankheiten

Die Automatisierung der Nukleinsäureextraktion zur Präparation von viraler RNA für die Echtzeit-PCR ist ein großer Gewinn für Laboratorien und liefert eine zuverlässige, beständige und schnelle Methode, um die Ausbreitung von Krankheiten bei Nutztieren zu überwachen. Die automatisierte Probenpräparationsplattform Freedom EVO bietet die notwendige Flexibilität und Kapazität für den Umgang mit äußerst wechselhaften Auslastungen und plötzlichen Krankheitsausbrüchen. Aufgrund dieser Flexibilität kann ohne weiteres zwischen verschiedenen Krankheitstests gewechselt werden. So kann das Labor schnell auf ein unvorhersehbar und von einem Tag zum anderen wechselndes Probenaufkommen reagieren. Die Arbeitsstation lässt sich außerdem mit einer Auswahl zusätzlicher Vorrichtungen kombinieren, sodass sich der Anwender leicht auf zukünftige Anforderungen einstellen kann.

Hintergrund: Die Blauzungenkrankheit – Seit 2006 vermehrtes Auftreten in Mitteleuropa

Die Blauzungenkrankheit befällt Wiederkäuer, in erster Linie Schafe und Rinder, und wird von einem Virus der Gattung Orbivirus ausgelöst. Die Krankheit ist durch verschiedene Symptome gekennzeichnet, die bei Schafen und Rindern unterschiedlich ausfallen, aber im Allgemeinen Fieber, eine Anschwellung von Kopf und Hals sowie Veränderungen an den Schleimhäuten von Maul und Nase und am Kronenrand des Hufes einschließen. Die Symptome können von subklinisch bis fatal reichen, wobei die Sterblichkeitsrate bei einigen Schafrassen hoch ist. Es gibt derzeit keine wirksame Behandlung für die Blauzungenkrankheit. Da die Krankheit für Landwirte verheerende wirtschaftliche Folgen haben kann, ist eine strenge Überwachung mit schnellen, empfindlichen und zuverlässigen Nachweisverfahren überaus wichtig. Das Blauzungenvirus wird durch Stiche von Mücken der Gattung Culicoides übertragen. Die Hauptüberträgerspezies C. imicola kommt normalerweise in wärmeren, mediterranen Gegenden Europas vor. So war die Blauzungenkrankheit von jeher auf diese Gebiete beschränkt und trat dort nur sporadisch auf. Seit 1998 haben sich die Fälle der Blauzungenkrankheit in Europa weiter nördlich ausgebreitet, was vermutlich am Klimawandel infolge der globalen Erwärmung liegt [1]. Der erste gemeldete Fall der Blauzungenkrankheit in Nordeuropa trat im August 2006 in den Niederlanden auf. Die Krankheit breitete sich damals schnell bis in die nordrhein-westfälische Region aus. Auch aus Belgien, Deutschland, Frankreich und Luxemburg kamen Meldungen über Krankheitsfälle. 2007 trat die Krankheit erneut auf und infizierte noch mehr Rinder- und Schafbestände in diesen Ländern. Weitere Meldungen kamen aus Großbritannien im September, der Schweiz und Dänemark im Oktober und der Tschechischen Republik im November. Die Krankheit war eindeutig in der Lage, den Winter zu überstehen.

[1] Purse BV, Mellor PS, Rogers DJ, Samuel AR, Mertens PPC, Baylis M (2005) Climate change and the recent emergence of bluetongue in Europe. Nature Reviews Microbiology 3: 171-181.

Dr. Claudia Bunzenthal von der Arbeitsgemeinschaft Chemisches- und Veterinäruntersuchungsamt (Rhein-Ruhr-Wupper) wird für ihre Hilfe bei der Vorbereitung dieses Artikels gedankt.

*Dr. Izabela Noll, Tecan Schweiz AG, 8708 Männedorf/Schweiz

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