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Alternative zu Tierversuchen

Testung mithilfe von Zell-basierten Lab-on-a-Chip-Systemen

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Leistungsfähige Sensorzelllinie

Für den Proof-of-concept wurden verschiedene Pflanzenextrakte mit bekannten zytotoxischen, reizenden sowie ggf. entzündungsfördernden und allergieauslösenden Effekten gewählt, die u. a. Anwendung in entsprechenden kosmetischen und pharmazeutischen Produkten finden. So zum Beispiel die echte Arnika, die Hundskamille, die gewöhnliche Sonnenbraut und das gewöhnliche Seifenkraut. Die Ergebnisse bestätigen die Leistungsfähigkeit der Sensorzelllinie: Für die echte Arnika, die ein starkes Kontaktallergen ist, wurde eine hohe Signalintensität gemessen, während die anderen Substanzen, wie erwartet, aufgrund des wesentlich geringeren zellschädigenden Potenzials bzgl. ihrer Messwerte deutlich darunter lagen (s. Abb. 3). Insbesondere das gewöhnliche Seifenkraut, dessen zytotoxische Wirkung auf der Zerstörung der Zellmembran und nicht auf der Bildung von ROS beruht, zeigt ein deutlich geringeres Signal. Das Sensorsystem ermöglicht es also, unterschiedliche Signal- und damit Toxizitätswege zu diskriminieren.

Die Untersuchung von gewöhnlichen Chemikalien mit dem Sensor zeigte ebenfalls dessen Leistungsfähigkeit. Unter anderem wurde Di-Nitrochlorbenzen (DNCB) und Nickelsulfat auf ihre zytotoxische Wirkung getestet. Es zeigte sich, dass DNCB in Übereinstimmung mit der bekannten kontaktallergischen Wirkung ein hohes Signalniveau lieferte (s. Abb. 4), während Nickelsulfat, das einen alternativen Zellschädigungsmechanismus beinhaltet, ein vergleichsweise geringes Signal lieferte, was ebenfalls die Möglichkeit aufzeigt, zwischen unterschiedlichen Schädigungsmechanismen zu unterscheiden.

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Implementierung des zellbasierten Assays auf das Lab-on-a-Chip-System

Aufbauend auf diesen Ergebnissen wurde ein Chipsystem entwickelt, welches, eingebunden in eine mikrofluidische Plattform, die Kombination beider Detektionsverfahren zur multiplen, zeitaufgelösten Detektion hautschädigender Effekte ermöglicht. Das in Abbildung 5 illustrierte dreilagige Chipsystem besitzt neun Zellkulturkammern, sodass jeweils eine Dreifachbestimmung der Untersuchungssubstanz, einer Positiv- und Negativkontrolle möglich ist. Die Zellen adhärieren auf planaren Elektroden auf der untersten Ebene, welche gleichzeitig eine Temperiereinheit enthält, um die Zellen auf Körpertemperatur von 37 °C zu kultivieren. Die mittlere Lage nimmt die Gefäße für die Zellen auf. Zu den Zell-Reservoiren führen sowohl die Zuleitungen der zu testenden Substanzen als auch der notwendigen Nährstoffe zur Zellversorgung, sowie auf der anderen Seite der Auslauf der verbrauchten Medien. Nicht zu vergessen, ist der mikrofluidische Mischer, der Zellkulturmedium und Testsubstanzen auch bei geringsten Flüssen effektiv mischt und dafür sorgt, dass alle Reservoire die gleiche Menge an Testsubstanz und Zellkulturmedium erhalten.

Eine weitere entscheidende Voraussetzung für die effektive Nutzung von zell-basierten Lab-on-a-Chip-Systemen ist die Möglichkeit der Nutzung dieser Systeme außerhalb eines Laborinkubators bei gleichzeitigem Erhalt der notwendigen sterilen Bedingungen. Mit der Entwicklung der Sensorzelllinie und der Implementierung dieser in das Chipsystem ist es gelungen, die transfizierte Sensorzelllinie außerhalb des Inkubators unter sterilen Bedingungen zu kultivieren und die vorgesehenen Untersuchungen während der gesamten Kultivierungszeit ohne Öffnen des Systems durchzuführen. Dazu wurde das Chip-System auf beiden Seiten durch Sterilfilter verschlossen und die Zellen durch ein CO2-unabhängiges Kultur-Medium bei gleichmäßiger Temperierung auf 37 °C erfolgreich am Leben erhalten. Es konnte gezeigt werden, dass die Zellen im Chip-System mit der gleichen Proliferationsrate wachsen, wie sie es in einer klassischen Kulturflasche tun.

Als Referenzsystem für die Stress-induzierende Wirkung von Kosmetika-Bestandteilen wurde, wie schon erwähnt, CdCl2 benutzt. Hier zeigte sich eine geringere Proliferationsrate (unter dem Mikroskop beobachtet) und ein Impedanzsignal, das ein beginnendes Absterben der Zellen detektierte. Die Nachweisgrenze lag bei 6 µM CdCl2 und damit weit unterhalb der Signifikanzschwelle für Kosmetika.

Insgesamt ist es mit der Entwicklung des Sensorzellkonstruktes und des Lab-on-a-Chip-Systems mit Inkubator-unabhängiger Kultivierung gelungen, ein zumindest für ein Pre-Screening von Einsatzstoffen in der Kosmetik-Industrie und darüber hinaus für die Testung neuer Chemikalien im Sinne der REACH-Verordnung der EU, ideal geeignetes Testsystem zu entwickeln. Es erlaubt einen Nachweis der toxischen Wirkung weit unterhalb der Absterbensschwelle der Zellen („schwache Wechselwirkung“) und ermöglicht, zwischen unterschiedlichen Zellschädigungsmechanismen zu unterscheiden.

* Prof. Dr. rer. nat. habil. K.H. Feller: Institut für Mikrosystem- und Präzisionsfertigungstechnik, Bereich Instrumentelle Analytik, Ernst-Abbe-Hochschule Jena, 07745 Jena

* *Dr. rer. nat. U. Hofmann: Analytik Jena AG, 07749 Jena

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