Worldwide China

Alternative zu Tierversuchen

Testung mithilfe von Zell-basierten Lab-on-a-Chip-Systemen

| Autor / Redakteur: Karl-Heinz Feller* und Ute Hofmann** / Dr. Ilka Ottleben

Abb. 1: Schema des Gesamtaufbaus des Lab-on-a-Chip-Systems zur Messung der Zellstress-Belastung von HaCaT-Zellen ... (Ausschnitt)
Abb. 1: Schema des Gesamtaufbaus des Lab-on-a-Chip-Systems zur Messung der Zellstress-Belastung von HaCaT-Zellen ... (Ausschnitt) (Bild: Ernst-Abbe-Hochschule Jena)

Nicht zuletzt seit der EU-Verordnung über Tierversuche, die seit 2009 den Einsatz von Tieren für die Testung von Kosmetika-Rohstoffen verbietet, sind alternative Verfahren gefragt. Zell-basierte Lab-on-a-Chip-Systeme bieten hier einen vielversprechenden Ansatz.

Die Testung von neuen Einsatzstoffen für die Kosmetikbranche, aber auch die Verwendung von alltäglichen Chemikalien in Haushalt und Alltag stellt eine immer größere Herausforderung dar. Aufgrund der EU-Verordnung über Tierversuche, dürfen diese seit 2009 nicht mehr für Testungen von Kosmetika-Rohstoffen herangezogen werden. Weiterhin fordert die Europäische Chemikalienverordnung zur Registrierung, Bewertung, Zulassung und Beschränkung chemischer Stoffe (REACH) eine genaue Risikobewertung der Wirkung von Chemikalien auf Mensch und Umwelt. Geeignete Alternativen zu Tierversuchen sind also dringend erforderlich.

Ziel der hier vorgestellten Arbeit war die Entwicklung eines schnellen und einfachen In-vitro-Testsystems zur Bewertung der toxikologischen Verträglichkeit von Pflanzenextrakten bzw. chemischen Substanzen auf humane Hautzellen (Zelllinie: HaCaT). Im Unterschied zu den bisher existierenden Tests, die im wesentlichen Endpunktverfahren sind und damit nur eine Aussage über den eingetretenen Zelltod erlauben, wurde hier ein Verfahren entwickelt, bei dem zu jeder beliebigen Zeit eine Stress-Wirkung in Form einer Hautreizung auf die Zellen analysiert werden kann (s. Abb. 1 für das Lab-on-a-Chip-Konzept). Hierbei sollte u. a. die Unterscheidung der zellschädigenden Wirkung nach der Stärke der Stressbelastung erfolgen. Zum einen führt eine starke Belastung zum Absterben der Zellen (Apoptose), während der hier relevante Fall einer leichten Stressbelastung zum Reiz- bzw. Stresszustand der Zelle führt. Bei extrem geringen Belastungen kann es auch dazu führen, dass überhaupt keine Veränderungen der Zelle nachweisbar sind. Auf dieser Grundlage wurde die Entwicklung eines schnellen Verfahrens auf Basis eines Lab-on-a-Chip-Systems unter Einsatz früher Biomarker angestrebt.

Etablierung des fluoreszenzbasierten Assays

Zur Etablierung des Assays war es als erstes notwendig, einen universellen Biomarker zum Nachweis von Stressreaktionen zu identifizieren. Es zeigte sich, dass Hitzeschockproteine (HSP) in der Signalkaskade der Zellen geeignete frühe Biomarker sind. Dazu wurden insgesamt drei als besonders effektiv erscheinende HSPs auf ihre Wirkung untersucht. In einem ersten Durchlauf erwies sich das HSP 72 mit einer ca. 20-fachen Erhöhung des relativen mRNA-Niveaus bei Inkubation mit CdCl2 als ausreichend empfindlicher Stress-Indikator. Ursache dafür ist die Erzeugung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) innerhalb der Signalkaskade in den Zellen. Aufbauend auf diesen Ergebnissen wurde die Sensorzelllinie aus HaCaT-Zellen, die stabil mit dem Plasmid pHSP72p-AcGFP transfiziert wurde, hergestellt. Dieses Konstrukt ist mit der Expression von grün fluoreszierenden Proteinen (GFP) unter Einfluss des HSP72-Promoters verbunden. Unter Stressbelastung zeigen die modifizierten HaCaT-Zellen ein grünes Fluoreszenzsignal, dessen Intensität eine Aussage zur Höhe/Stärke der Stress-Belastung ermöglicht (s. Abb. 2).

Von CdCl2 ist bekannt, dass es eine starke toxische Wirkung auf Hautzellen ausübt. Dabei liegt der EC50-Wert für normale Kulturbedingungen bei 110 µM. Für die Bedingungen einer schwachen Wechselwirkung wurden deshalb Konzentrationen zwischen 0 und 100 µM gewählt. Es zeigte sich bis zu Konzentrationen von 35 µM ein erwarteter starker Anstieg des Fluoreszenzsignals. Wurde die Konzentration weiter erhöht, zeigten die Zellen eine ungewöhnliche Morphologie und einige Zellen starben, was mit dem beobachteten Abfall der Fluoreszenzintensität einhergeht (s. Abb. 2).

Durch Kombination der fluoreszenzoptischen Sensorzelllinie mit einem zweiten, von intrazellulären Prozessen unabhängigen Detektionsverfahren könnte eine noch komplexere Beschreibung der infolge der Einwirkung einer zellschädigenden Substanz auftretenden Effekte möglich sein (s. Abb. 1). Neben der Messung der Fluoreszenzintensität in Abhängigkeit vom Grad der Zellstressbelastung ist mithilfe einer optischen Detektionseinheit die unerlässliche mikroskopische Kontrolle der Zellkultur möglich. Qualitative Aussagen zur Zelldichte und Zelladhäsion können getroffen werden. Das Verfahren der Impedanzspektroskopie jedoch ermöglicht die passive quantitative Beschreibung morphologischer Veränderungen der Zellen und spiegelt die Zellantwort bis zur vollständigen Permeabilisierung wider.

Der direkte Vergleich der labelfreien impedimetrischen Daten mit den Ergebnissen des Reportergenassays basierend auf HSP72 zeigte die individuellen Stärken und Limitationen der Assays auf. Während mittels Reportergenassay der Effekt besonders geringer CdCl2-Konzentrationen nachgewiesen werden konnte, erlaubte die Impedanzspektroskopie die Detektion höherer, eine akute Toxizität hervorrufender Konzentrationen des analysierten Umwelttoxins.

Inhalt des Artikels:

Kommentare werden geladen....

Kommentar zu diesem Artikel abgeben

Der Kommentar wird durch einen Redakteur geprüft und in Kürze freigeschaltet.

  1. Avatar
    Avatar
    Bearbeitet von am
    Bearbeitet von am
    1. Avatar
      Avatar
      Bearbeitet von am
      Bearbeitet von am

Kommentare werden geladen....

Kommentar melden

Melden Sie diesen Kommentar, wenn dieser nicht den Richtlinien entspricht.

Kommentar Freigeben

Der untenstehende Text wird an den Kommentator gesendet, falls dieser eine Email-hinterlegt hat.

Freigabe entfernen

Der untenstehende Text wird an den Kommentator gesendet, falls dieser eine Email-hinterlegt hat.

copyright

Dieser Beitrag ist urheberrechtlich geschützt. Sie wollen ihn für Ihre Zwecke verwenden? Infos finden Sie unter www.mycontentfactory.de (ID: 43860662 / Bio- & Pharmaanalytik)