Wachstumshormon im Serum per Isoptopenverdünnungmassenspektrometrie bestimmen

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Physikalisch-Technische Bundesanstalt (PTB)

Zur Übertragung der IDMS auf die Quantifizierung von Markerproteinen bedient man sich Methoden zur Probenvorbereitung aus der Proteomik. Die direkte Quantifizierung intakter Proteine ist möglich, jedoch technisch problematisch. Es werden stattdessen stellvertretend „Fingerprint-Fragmente“ des Zielproteins nach vollständiger Proteolyse mit Trypsin oder anderen Proteasen bestimmt (s. Abb. 1). Die Ionenchromatogramme der Quantifizierung einer mit Hypophysenextrakt gespikten Serumprobe in Abbildung 1 (gemessene Konzentration: 12 µg/L) sind für T6- bzw. T6*-spezifische MS-MS-Übergänge aufgenommen. Sie sind für das Fragment T6 und den internen Standard T6* farblich blau (T6) bzw. rot (T6*) hervorgehoben. Die Fragmentierungsstellen des Trypsins in der Wachstumshormon-Sequenz sind durch Scheren markiert. Aminosäuresequenzen sind im Einbuchstabencode dargestellt.

Anreicherungsmethoden

Das Zielprotein kann direkt aus dem Serum angereichert werden. Hierzu ist als interner Standard das isotopenmarkierte intakte Protein notwendig, um Substanzverluste des Zielproteins während der Anreicherung zu kompensieren. Das Zielprotein kann beispielsweise durch Immunopräzipitation mit immobilisierten Antikörpern angereichert werden (s. Abb. 2A). Setzt man dabei polyklonale Antikörper ein, so ist die Wahrscheinlichkeit größer, auch Isoformen des Zielproteins mit anzureichern, um ihre quantitative Zusammensetzung zu bestimmen. Der angereicherte Extrakt wird proteolysiert und ausgewählte Fragmente als Surrogate des intakten Proteins mit IDMS bestimmt. Ein Nachteil dieser Anreicherungsmethode ist die geringe Verfügbarkeit isotopenmarkierter intakter Proteine.

Eine andere Möglichkeit besteht darin, dass zunächst das ganze Serum proteolysiert wird. Ausgewählte Fragmente des Zielmoleküls werden anschließend von störenden Matrixbestandteilen abgetrennt und mit IDMS bestimmt. Unter der Voraussetzung, dass die Fragmente durch Proteolyse vollständig also quantitativ aus dem Zielprotein freigesetzt werden, können für diese Art der Anreicherung auch isotopenmarkierte Fragmente als interne Standards eingesetzt werden. Diese sind durch chemische Synthese leicht zugänglich und preiswert. Je langsamer die Freisetzung des Analyten aus dem Protein erfolgt, desto länger liegen strukturelle Unterschiede zu dem internen Standard vor, was zur Folge haben kann, dass Substanzverluste nicht vollständig durch das isotopenmarkierte Fragment kompensiert werden. Die ausgewählten Fragmente müssen daher chemisch stabil sein, und die Bedingungen sind so zu wählen, dass die Proteolyse schnell verläuft, um eine hohe Genauigkeit der Proteinquantifizierung zu erreichen. Unter Verwendung des isotopenmarkierten intakten Proteins als internem Standard entfällt das Problem einer unvollständigen Proteolyse, da die Freisetzung der Fragmente analog zum Zielprotein erfolgt.

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