Wachstumshormon im Serum per Isoptopenverdünnungmassenspektrometrie bestimmen

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Physikalisch-Technische Bundesanstalt (PTB)

Die Anreicherung der Fragmente und ihrer isotopenmarkierten Gegenstücke kann wie bei den intakten Proteinen durch Immunopräzipitation an immobilisierten fragmentspezifischen Antikörpern erfolgen (s. Abb. 2B). Die Selektivität der Anreicherung lässt sich steigern, wenn man mono- statt polyklonale Antikörper einsetzt. Als Alternative bietet sich die Anreicherung durch semipräparative Flüssigchromatographie an (s. Abb. 2C). Im vorliegenden Fall erfolgte dies schrittweise mit semipräparativer RP- und starker Kationenaustausch- (SCX)-Flüssigchromatographie. Das Zielprotein, schematisch als Schleife dargestellt, und eines seiner Fragmente, das als Kreis dargestellt ist, sind farblich hervorgehoben (s. Abb. 2C): natürlich (blau); isotopenmarkiert (rot). Andere Matrixbestandteile des Serums und des Proteolysats sind farblich grau gekennzeichnet. Gegenüber immunologischen Verfahren zur Anreicherung, die für jedes ausgewählte Fragment einen spezifischen Antikörper erfordern, hat die Flüssigchromatographie den Vorteil der höheren Flexibilität im Bezug auf die Auswahl an Fragmenten, die stellvertretend für das Zielprotein mit IDMS bestimmt werden.

Analysenbedingungen

Die Auswahl der zu bestimmenden chemisch stabilen Fragmente erfolgt danach, welche entsprechenden Isoformen des Zielproteins man quantifizieren möchte. Die massenspektrometrische Detektion der Fragmente muss auch ausreichend empfindlich sein. Überschneidungen mit Sequenzen anderer Serumproteine können bei der Auswahl der Fragmente durch Datenbank-Recherchen vermieden werden.

Die massenspektrometrische Bestimmung von menschlichem Wachstumshormon mit der Methode der vorangehenden Proteolyse des gesamten Serums durch Trypsin und der anschließenden flüssigchromatographischen Anreicherung von zwei Fragmenten T6 und T12 (s. Abb. 3) und ihrer isotopenmarkierten Gegenstücke ist für Konzentrationen im Bereich 3 bis 30 µg/L validiert.

Die Fragmente T6 und T12 werden durch zweidimensionale semipräparative Flüssigchromatographie aufgereinigt. Im ersten Schritt werden sie an einer Reversed Phase (RP)-Säule vorgereinigt. Je eine angereicherte Fraktion für T6 und eine für T12 wird aufgefangen und anschließend mittels starker Kationenaustausch-(SCX)-Chromatographie weiter aufgereinigt. Nach der Entsalzung durch Festphasenextraktion an C18-Kartuschen werden die angereicherten Fragmente durch Kopplung von RP-Flüssigchromatographie mit tandem-massenspektrometrischer Detektion (LC/MS-MS) quantifiziert. Aus dem Verhältnis der Signale vom Fragment, das infolge der Proteolyse aus dem Wachstumshormon freigesetzt wird, und von dem vor der Proteolyse zum Serum zugesetzten isotopenmarkierten Standard wird die Menge an Wachstumshormon in der Probe bestimmt. Für den definierten Zusatz an Wachstumshormon und Standards werden Stammlösungen hoher Reinheit verwendet, deren Konzentrationen nach Spaltung der Referenzsubstanzen in Aminosäuren durch Aminosäureanalyse mit IDMS bestimmt werden.

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