Weniger Tierversuche – Zellähnliche Nanokompartimente für den Toxin-Nachweis

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Eidgenössisch Technische Hochschule Zürich Instiute of Food, Nutrition and Health

Suche nach Alternativen, die die Anzahl der Tierversuche verringern

Aus diesem Grunde bestehen weltweit Bestrebungen gemäß den Prinzipien der so genannten 3R (refine, reduce, replace) den bisherigen Tierversuch zu ersetzen. Anpassung von Versuchsbedingungen sollen zum Beispiel helfen zumindest das Leiden der Versuchstiere zu mindern (refine), verbesserte Auswertungs- und Interpretationsmethoden hingegen haben das Ziel die Zahl der benötigten Versuchstiere zu verringern (reduce). Die größte Herausforderung besteht jedoch darin, eine Methode zu finden, die es ermöglicht, den Maus-LD50-Test vollumfänglich zu ersetzen.

Viele der bekannten tierversuchsfreien Methoden (replace) scheiterten bisher jedoch an der komplizierten biologischen Funktion des Toxins. Die Wirkung des Toxins findet vor allem an den so genannten Motoneuronen statt. Über die Ausscheidung bestimmter Botenstoffe sorgen diese Nervenzellen dafür, dass sich die folgenden Muskelzellen kontrahieren. Über einen komplizierten Mechanismus kann das Toxin an die Zelloberfläche von Motoneuronen binden und anschließend einen Teil, die so genannte leichte Kette, in das Zellinnere einschleusen.

Diese leichte Kette wiederum spaltet im Zellinneren bestimmte Proteine, die normalerweise an der Ausscheidung des Nervenbotenstoffes beteiligt sind (s. Abb. 1). Wird dieser Botenstoff nicht mehr ausgeschieden, so kontrahieren sich die folgenden Muskelzellen nicht und bleiben gelähmt [7]. Der Nachweis einer solch komplexen Abfolge von Reaktionen war bisher Tier- bzw. Zellkulturversuchen vorbehalten. Ziel der Arbeit war es daher, ein Testsytem zu finden, dass einerseits den Nachweis des Toxins unter möglichst realitätsnahen Bedingungen erlaubt, gleichzeitig aber weniger Nachteile als ein entsprechender Zellkulturtest aufweist (z.B. aufwändige Pflege und komplizierte Testung). Um dies zu ermöglichen, wurden so genannte Liposomen verwendet. Je nach Zusammensetzung der verwendeten Membranbestandteile lassen sich damit bis zu einem gewissen Grad bestimmte Zelltypen simulieren. Um die entsprechenden Liposomen herzustellen, wurden zunächst die so genannte Dry-lipid-film-hydration-Methode verwendet. Dabei werden die später in der Liposomenmembran gewünschten Lipide bzw. Lipidrezeptoren in einem organischem Lösungsmittel gelöst. Nach Verdampfen des Lösungsmittels bleibt eine dünne Lipidschicht an der Gefäßwand zurück, zu welcher der entsprechende wässrige Puffer hinzugegeben wird.

Da sich die Lipide in wässrigen, eher unpolaren Flüssigkeiten nicht lösen können bildet sich eine Emulsion, eine trübe, weißliche Flüssigkeit, wie man sie z.B. auch bei Milch kennt. Diese Emulsion besteht aus Abermillionen Liposomen in unterschiedlichsten Formen und Größen. Um eine gleichmäßige Verteilung zu erreichen, werden die Liposomen anschließend mit einem so genannten Extruder bis auf etwa 100 nm verkleinert (s. Abb. 2). Da die Lichtstrahlen durch diese kleinen Partikeln kaum noch gebrochen werden, erscheint die Emulsion nun nahezu transparent.

Liposomaler Nachweis von Botulinum Neurotoxin

Um den Nachweis der verschiedenen Reaktionsschritte des Toxins zu ermöglichen, wurden die Liposomen nicht nur mit den entsprechend Lipiden versehen, sondern auch die entsprechenden Rezeptorproteine in die Liposomenmembran integriert welche das Toxin normalerweise am Motoneuron bindet. Sobald das Toxin die Rezeptoren in der Liposomenmembran gebunden hat, wird analog zum Prozess in der lebenden Zelle, die umgebende Flüssigkeit angesäuert, wodurch die leichte Kette des Toxins in das Innere des Liposoms geschleust werden kann (s. Abb. 3). Da die Spaltung nur nach erfolgreicher Bindung des Toxins und Überführung der kleinen Untereinheit in das Liposom erfolgt, zeigt das Fluoreszenzsignal somit an, dass alle nötigen physiologischen Reaktionen stattgefunden haben. Die Messung erlaubt somit einen funktionellen Nachweis des Toxins.

Weitere Entwicklung des Testverfahrens

Noch steckt das Testsystem in den Kinderschuhen. Entwicklungs- bzw. Optimierungsarbeiten sind jedoch bereits im Gange, um das Nachweisverfahren verlässlich genug zu machen, damit auch die Testung BoNT-haltiger pharmazeutischer Präparate mittelfristig möglich ist.

Sobald der Test die Anforderungen der Zulassungsbehörden erfüllt, wäre hoffentlich auch ein Ersatz des Maus-LD50-Test möglich. Auch wäre eine Erweiterung des Testsytems denkbar, um ähnlich wirkende Toxine nachzuweisen.

Das Projekt, dass an der ETH Zürich am Lehrstuhl für Lebensmittelmikrobiologie von Prof. Dr. Martin Loessner durchgeführt wird erfährt Unterstützung von zwei deutschen Forschergruppen bei den Firmen miprolab GmbH aus Göttingen bzw. toxogen GmbH aus Hannover sowie dem Labor Spiez des schweizerischen Bundesamts für Bevölkerungsschutz. Das Projekt wird zudem gefördert durch die Schweizer Stiftung Forschung 3R.

Literatur:

[1] Dressler D (2012) Clinical applications of botulinum toxin. Current opinion in microbiology 15(3):325-336.

[2] Abrams SB & Hallett M (2013) Clinical utility of different botulinum neurotoxin preparations. Toxicon.

[3] Kerner J (1817) Vergiftung durch verdorbene Würste. Tübinger Blätter für Naturwissenschaften und Arzneyenkunde 3(1):1-25.

[4] Weingart OG, et al. (2012) A bioanalytical platform for simultaneous detection and quantification of biological toxins. Sensors (Basel) 12(2):2324-2339.

[5] EDQM (2011) 07/1022:2113 Botulinum toxin type A for injection. European Pharmacopoeia 7.2), pp 3613-3615.

[6] Bitz S (2010) The botulinum neurotoxin LD50 test - problems and solutions. ALTEX 27(2):114-116.

[7] Binz T & Rummel A (2009) Cell entry strategy of clostridial neurotoxins. J Neurochem 109(6):1584-1595.

[8] Lalli G, Bohnert S, Deinhardt K, Verastegui C, & Schiavo G (2003) The journey of tetanus and botulinum neurotoxins in neurons. Trends Microbiol 11(9):431-437.

* Dr. O. Weingart: Institute of Food, Nutrition and Health, ETH Zurich, 8092 Zürich/Schweiz

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