Zellmigration Zellmigration unter dem Mikroskop

Forscher haben ein Testsystem entwickelt, mit dem sich Ursachen und Steuerungsmechanismen der Zellmigration quantitativ untersuchen lassen. Die richtigen Kulturbedingungen spielen eine entscheidende Rolle.

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LAUDA DR. R. WOBSER GMBH & CO. KG

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Die Migration von Zellen spielt in physiologischen und pathologischen Prozessen eine zentrale Rolle. Vom Verständnis der beteiligten zellulären und molekularen Interaktionen erhoffen sich Forscher neue und effizientere Therapieansätze. So zum Beispiel in der Neurologie zur Behandlung der Querschnittslähmung oder in der Dermatologie zur Wundbehandlung. Auch die Metastasen-Behandlung bei Krebs könnte auf diese Weise verbessert werden. In den letzten Jahren haben insbesondere in-vitro-Studien wichtige Beiträge zur Erforschung pathologischer Organveränderungen und möglicher Therapieansätze geleistet. So erhofft man sich heute etwa durch die gezielte Reimplantation von Stammzellen erstmals effektive Therapiechancen bei kardiovaskulären Erkrankungen. In-vitro-Studien bieten den Vorteil, dass die Zelldifferenzierung und Entwicklung unter exakt definierten und reproduzierbaren Parametern analysiert werden kann. Einzelne Wachstumsfaktoren oder extrazelluläre Matrixbestandteile lassen sich einfach und gezielt variieren und der Einfluss auf die zelluläre Entwicklung überprüfen. Die Aufklärung dieser essenziellen Faktoren geht dabei eng mit labortechnischen Weiterentwicklungen einher.

Fortschritte beim Online-Monitoring

Eine neue Technik gewinnt im Zuge dieser Entwicklung immer mehr an Bedeutung: die Langzeit-Beobachtung lebender Zellen direkt auf dem Mikroskoptisch. Gegenüber der zeitlich begrenzten und sporadischen Beobachtungsmöglichkeit in konventionellen Inkubatorsystemen bietet das neue Verfahren den Vorteil, die Zellen kontinuierlich und schonend beobachten zu können. Zu den Pionieren der Mikroskop-Inkubation zählt Okolab. Das von Zellbiologen und Technikern gemeinsam entwickelte Inkubatorsystem (s. Abb. 1) vereint drei präzise aufeinander abgestimmte Komponenten: Einen Mikroskop-Inkubator, ein Präzisions-Thermostat und ein hochauflösendes Inversmikroskop. Der Mikroskop-Inkubator lässt sich an unterschiedliche Fragestellungen und Kulturtechniken anpassen. Er ermöglicht die sichere Online-Beobachtung der Zellen, ohne negative Beeinflussung des Zellwachstums. Der Präzisions-Thermostat Ecoline E 203 von Lauda eignet sich speziell für empfindliche Zellkulturanwendungen. Er sichert die für eine schonende Langzeit-Kultur notwendigen Kulturbedingungen. Zudem temperiert er die optisch sensiblen Inkubatorbereiche und sorgt so für ein ortsstabiles und klares lichtmikroskopisches Beobachtungsfeld. Das Inversmikroskop als dritte Komponente, verfügt je nach Fragestellung und eingesetzten zellulären Markersubstanzen über unterschiedliche Beobachtungsmodalitäten wie Fluoreszenz oder Phasenkontrast-Beleuchtung. Die Okolab System-Software integriert diese drei Module zu einer leistungsfähigen und einfach zu bedienenden Arbeitsplattform. Auf der Plattform können verschiedene Kulturgefäßformate verwendet werden (s. Abb. 2). Ein kontrolliertes, stabiles Wassermantelsystem mit externem Sensor gewährleistet die Temperiergenauigkeit. Das zellfreundliche Langzeit-Klima mit hoher Luftfeuchte und Verlässlichkeit wird durch die kontinuierliche Überwachung des Gesamtsystems aufrecht erhalten. Somit sind Computergesteuerte Zeitraffer-Studien von komplexen Migrationsprozessen mit einem Minimum an Aufwand schon nach kurzer Einarbeitungszeit möglich.

Charakterisierung der Zellmigration

Wissenschaftler am Erasmus MC – University Medical Center Rotterdam haben einen neuen Barriere-Test entwickelt, mit dem sich Ursachen und Steuerungsmechanismen der Zellbewegung untersuchen lassen. Dazu hat das Forscherteam um Remco van Horssen das Okolab Inkubations- und Beobachtungssystem für die quantitative Charakterisierung spezifischer Migrationsmuster eingesetzt [1]. Der Test ermöglicht Studien an unbeschädigten Monoschichten von Zellen entlang unversehrter und definierter Matrices. Als Zellen werden humane Endothelzellen aus der Nabelschnur, mikrovaskuläre Endothelzellen und Fibroblasten verwendet. Bei den Versuchen gilt das besondere Interesse zunächst dem Einfluss der extrazellulären Matrix-Komponenten Fibronectin (FN) und Kollagen-I (Col-I) auf das von vascular-endothelial-growth-factor- (VEGF), basic-fibroblast-growth-factor- (BFGF), und lysophosphatidic-acid- (LPA) induzierte Wachstum. Die Besonderheit des Migrationstests besteht in einer Wachstumsbarriere, die während der Startphase des Tests im Inneren der Kulturschale angebracht wird. Diese trennt einen kleineren Innensektor von einem größeren Außenbereich der Kulturschale (s. Kasten oben). Der Bereich im Zentrum der Kulturschale wird je nach Fragestellung vor Versuchsbeginn mit einem definierten Oberflächensubstrat (FN oder Col-I) behandelt. Die Zellen vermehren sich zunächst nur auf der äußeren freien Fläche, während der Innenbereich für die Zellen nicht zugänglich ist. Erst nach Entfernen der Barriere können die Zellen auch zur Mitte hin auf dem modifizierten Testsubstrat einwachsen. Geschwindigkeit und Richtung dieser Zellbewegung werden von der spezifischen Oberfläche des zentralen Bereichs bzw. der Anwesenheit weiterer Wachstumsfaktoren beeinflusst. Über die Zeitraffer-Beobachtung der Migration identifizierter Zellen lassen sich die verschiedenen Einflussparameter quantitativ exakt bewerten.

Ergebnisse

Anhand der beobachteten Migrationsmuster fanden die Forscher heraus, dass Fibronectin und Kollagen-I die Zellmigration von Endothelzellen stimulieren. Die von Fibronectin induzierte Zellbewegung erscheint aber eher zufällig. Insgesamt ist die Zellbewegung auf der FN-Grundlage sogar verlangsamt. Die Zugabe der Wachstumsfaktoren BFGF und VEGF kompensiert diesen Effekt (Abb. 4). VEGF bewirkt zudem eine direktionale Zell-Bewegung. Bei den Fibroblasten verstärkt FN im Gegensatz hierzu die Zell-Beweglichkeit. Dieser Effekt kann durch BFGF nochmals erhöht werden. Versuche mit unterschiedlichen Konzentrationen an FN legen für Endothelzellen zudem einen konzentrationsabhängigen Effekt nahe. Die Versuche dokumentieren damit erstmals auch quantitativ das enge Wechselspiel zwischen Matrix-Komponenten und Wachstumsfaktoren. Sie erlauben ferner Einblicke in die Veränderung beteiligter Zellgerüst-Komponenten (s. Abb. 5). Eine fein abgestimmte Kombination dieser Faktoren reguliert demnach die gerichtete Zellwanderung und bestimmt deren Muster. Weitere Studien sollen das Bild vervollständigen.

Zusammenfassung

Das in-vitro-Barriere-Testsystem von Remco van Horssen und Kollegen [1] gestattet erstmals auch quantitative Einblicke in die Interaktion der Zellen mit beteiligten Wachstumsfaktoren und extrazellulärer Matrix ohne dabei den Zell-Monoschichten und Matrices Schaden zuzufügen. Im Okolab-Mikroskop-Inkubator lassen sich Endothelzellen und Fibroblasten bis zu mehreren Wochen kultivieren. Stabile Langzeit-Temperaturen durch die Ecoline-Staredition-Thermostate von Lauda und ein ideales Mikroklima bieten optimale Wachstumsbedingungen.

Hintergrund: Zellmigration

Die Zellmigration ist Bestandteil der komplexen Entwicklungsvorgänge von Lebewesen. Gerichtete Zellwanderungen finden in unterschiedlichsten Entwicklungsstadien statt. Sie beginnen bereits mit der Befruchtung der Eizelle und setzen sich in der Embryonalentwicklung und Organdifferenzierung fort. Über Ursachen und Determinanten der Zellmigration ist bis heute wenig bekannt. Aus pathologischer sowie therapeutischer Sicht sind sie aber von großem Interesse. Die Zellmigration ist Bestandteil degenerativer Organerkrankungen. Darüber hinaus spielt sie bei lebenswichtigen Reparaturprozessen im Körper eine wichtige Rolle.

Mikroskop-Inkubator: Optimale Kulturbedingungen für die Langzeit-Lebendzell-Beobachtung

Das Okolab-Kultursystem gestattet Lebendzell-Beobachtungen bis zu mehreren Wochen. Ein Befeuchtungsmodul mit Wasserreservoir verhindert das Verdunsten von Kulturmedium. Über ein Beheizungsmodul wird unerwünschte Oberflächen-Kondensation an den Kulturschalen vermieden, um jederzeit den unbeeinträchtigten Einblick zu ermöglichen. Durch die konstante CO2-Zufuhr können die vorgegebenen physiologischen pH-Werte im Kulturmedium eingehalten werden. Der Lauda-Ecoline-Staredition-Thermostat E 203 (s. Abb. 6) überwacht über ein Messverfahren mit externem Temperatursensor in einem Referenzkulturgefäß kontinuierlich den thermischen Systemzustand. Dies geschieht langzeitzuverlässig und mit einer Genauigkeit von +/- 0,1 °C. Neben der Standard-Version des Ecoline-Thermostaten steht für Kulturen im kühlen Bereich bis 10 °C auch ein Kältethermostat RE 204 zur Verfügung (s. Abb. 6). Selbst zyklische Temperaturverläufe lassen sich sicher und exakt simulieren. Ein Sicherheitssystem macht rechtzeitig auf Abweichungen vom Sollwert oder Unterschreiten des kritischen Wasserstands im Bad aufmerksam. Es greift auch bei unbeabsichtigtem Öffnen der Inkubatorabdeckung ein und verhindert so eine Überhitzung der Kulturen. Die präzise Temperaturführung verhindert darüber hinaus die Fokusdrift der Mikroskopeinrichtung während einer Langzeitbeobachtung.

Literatur:

[1] Remco van Horssen, Niels Galjart, Joost A. P. Rens, Alexander M. M. Eggermont and Timo L.M. ten Hagen. Differential Effects of Matrix and Growth Factors on Endothelial and Fibroblast Motility: Application of a Modified Cell Migration Assay, J. Cell. Biochem. 99: 1536–1552, 2006.

Dr. M. Seipel, Lauda Dr. R. Wobser GmbH & Co. KG, 97912 Lauda-Königshofen,

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