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CHROMATOGRAPHIE Algengifte in Muscheln besser nachweisen

| Autor / Redakteur: NORBERT HELLE* / Dipl.-Chem. Marc Platthaus

Muscheln können tödlich sein – insbesondere, wenn sie zur falschen Jahreszeit verzehrt werden. Grund sind Algengifte, die Schalentiere aufnehmen und im Gewebe anreichern. Um Verbraucher besser zu schützen, schreibt die Europäische Union (EU) routinemäßige Tierversuche vor.

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( Archiv: Vogel Business Media )

Muscheln können tödlich sein – insbesondere, wenn sie zur falschen Jahreszeit verzehrt werden. Grund sind Algengifte, die Schalentiere aufnehmen und im Gewebe anreichern. Um Verbraucher besser zu schützen, schreibt die Europäische Union (EU) routinemäßige Tierversuche vor. Deutsche Experten, wie der Chemiker Dr. Norbert Helle aus Bremerhaven, lehnen das ab – weil es für den Nachweis mariner Biotoxine, etwa für die hochgiftigen PSP-Toxine, mittlerweile ein deutlich besseres Nachweisverfahren gibt: die Flüssigchromatographie mit Fluoreszenzdetektion.

Der Herbst ist die Zeit, in der traditionell Muscheln auf dem Speiseplan stehen. Wie der Volksmund rät, sollten Muscheln auch nur in Monaten verzehrt werden, die ein „r“ im Namen tragen - also vor allem in der kalten Jahreszeit. Wer sich nicht an die Regel hielt und Schalentiere verzehrte, die etwa im Hochsommer geerntet wurden, riskierte früher eine Vergiftung mit so genannten marinen Biotoxinen, die Durchfall und Erbrechen auslösen, das vegetative Nervensystem stören, Lähmungserscheinungen hervorrufen oder in schwerwiegenden Fällen sogar den Tod herbeiführen können.

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Marine Biotoxine stammen aus Algen, die den Muscheln als Nahrung dienen. Algen können unterschiedliche Giftstoffe produzieren, die sich im Muschelgewebe anreichern. Das Risiko einer Vergiftung steigt insbesondere in warmen Sommermonaten, weil die Algenmenge im Meer mit der Wassertemperatur drastisch ansteigt. Das Nahrungsangebot ist deutlich erhöht, damit auch die Belastung der Muscheln mit marinen Biotoxinen.

Die verschiedenen Arten von marinen Biotoxinen

Zu den marinen Biotoxinen zählen unterschiedliche organische Verbindungen. Bei den PSP-Toxinen (Paralytic Shellfish Poisoning) handelt es sich um hochpolare Tetrahydropurin-Derivate. Es wurde bereits eine relativ große Anzahl unterschiedlich substituierter PSP-Toxine entdeckt, wobei nur ein Teil in den toxischen Algen, etwa den Alexandrium-Arten, direkt gebildet wird, während andere Derivate erst in der Muschel als Metaboliten entstehen. PSP-Toxine gehören zu den stärksten Biogiften überhaupt. Der Verzehr PSP-belasteter Muscheln kann das Nervensystem beeinträchtigen, zum Atemstillstand führen und zum Tod. DSP-Toxine (Diarrhetic Shellfish Poisoning) enthalten als Wirksubstanzen Verbindungen mit mehreren cyclischen Ethergruppen, so genannte Dinophysis-Toxine. Leitsubstanz ist die unter den DSP-Toxinen dominierende Okadasäure.

Eine Vergiftung mit DSP-Toxin kann zu Übelkeit, Erbrechen und Durchfall führen. DSP-Toxin produzierende Algen, etwa Dinophysis accuminata und Dinophysis acuta, treten zum Beispiel in der Nord- und Ostsee auf. Als Wirkstoff von ASP-Toxinen (Amnesic Shellfish Poisoning) wurde die Domoinsäure identifiziert. Die Domoinsäure beeinflusst das zentrale Nervensystem und kann ursächlich sein für den Verlust des Kurzzeitgedächtnisses (Amnesie).

Neben den drei Hauptgruppen mariner Biotoxine wurden weitere Toxine aus Algen oder Muscheln isoliert und aufgeklärt. Hierzu zählen Yessotoxine, Pectenotoxine und die Azaspirosäuren.

Richtlinien der EU - Verbraucherschutz im Blick

Als sich toxische Algen zunehmend in den Weltmeeren ausbreiteten und die Zahl der Erkrankungen zunahm, die auf den Verzehr von Muscheln zurückzuführen waren, wurde weltweit der Ruf nach einem besseren Verbraucherschutz laut. Die Europäische Union (EU) legte Richtlinien fest für die Kontrolle von Algentoxinen in Muscheln, die von den Mitgliedstaaten in nationales Recht umzuwandeln sind. Als Basis dient die Kommissionsentscheidung 2002/225/EG vom 15.03.2002, die eine zulässige Höchstmenge für die einzelnen Toxingruppen formuliert und die anzuwendenden Analysenmethoden festlegt. Die Umsetzung muss laut Verordnung (EG) Nr. 854/2004 (EU-Hygienepaket) bis 1. Januar 2006 erfolgt sein.

In Deutschland regelt die Fisch-Hygiene-Verordnung die Höchstmengen für ASP-Toxine (20 mg Domoinsäure/kg Muschelfleisch), DSP-Toxine (400µg/kg Muschelhepatopankreas) und PSP-Toxine (800 µg/kg Muschelfleisch). Allerdings ist Deutschland bei der Umsetzung der europäischen Vorgaben von den Analyserichtlinien abgewichen.

Die EU-Richtlinie sieht vor, den Nachweis von marinen Biotoxinen im Rahmen der Lebensmittelüberwachung routinemäßig mittels so genannter Bioassays zu erbringen, also mit Tierversuchen: Um zu prüfen, ob eine Belastung mit marinen Biotoxinen vorliegt, wird Mäusen ein aufbereiteter Extrakt aus dem zu untersuchenden Muschelgewebe in die Bauchhöhle injiziert. Stirbt die Maus, ist der Nachweis erbracht.

Die Anwendung eines Tests an Mäusen als routinemäßig einzusetzende Referenzmethode zum Nachweis der Algengifte wird unter anderem vom Bundesinstitut für Risikobewertung (BfR) kritisiert. In Deutschland werden chemisch-physikalische Verfahren eingesetzt und nur in Zweifelsfällen Tierversuche durchgeführt. Begründet ist dieses Vorgehen mit dem Anspruch, sowohl wissenschaftlich überprüfbare Methoden als auch das deutsche Tierschutzgesetz anzuwenden, wonach Tierversuche nur dann durchzuführen sind, wenn keine wissenschaftlich zufriedenstellenden, vertretbaren und praktikablen Alternativen zur Verfügung stehen. Was auch der europäischen Richtlinie zum Schutz von Versuchstieren entspricht.

Darüber hinaus ist die Anwendung der chemisch-physikalischen Messverfahren nach Ansicht des BfR dem Test an Mäusen überlegen und besser geeignet, einen sicheren Verbraucherschutz zu gewährleisten. Im Gegensatz zu diesen alternativen Methoden ist der Maus-Bioassay eine nicht nach wissenschaftlichen Kriterien überprüfte und genormte Methode. Am weitesten vorangeschritten ist die Entwicklung chemisch-physikalischer Methoden auf Basis der Hochdruckflüssigkeits-Chromatographie (HPLC), bei der hochempfindliche Messinstrumente das Vorhandensein von Toxinen anzeigen.

LC - Methode der Wahl zum Nachweis von PSP-Toxinen

Die chemische Struktur der PSP-Toxine basiert auf einem an mehreren Positionen substituierten Tetrahydropurin-Ring. Die bislang beschriebenen Derivate sind hochpolar, also sehr gut wasserlöslich, und verfügen über kein nennenswertes Chromophor. Für den notwendigen empfindlichen Nachweis der PSP-Toxine wurden deshalb bereits in den 80-er Jahren Methoden entwickelt, die auf der Fluoreszenzdetektion basieren [1], wobei man sich grundsätzlich die Bildung eines fluoreszenzaktiven aromatischen Systems durch Oxidation des Moleküls zu Nutze macht. Als Oxidationsmittel eignen sich unter anderem Wasserstoffperoxid und Perchlorsäure.

Während die von Lawrence et al. [1] beschriebene Vorsäulenderivatisierung den Vorteil eines einfacheren instrumentellen Aufbaus und geringeren Verbrauches an Reagenzien bietet, hat die On-Line-Nachsäulenderivatisierung den Vorteil eines geringeren manuellen Arbeitsaufwandes und der prinzipiell geringeren Standardabweichung. Beide Verfahren sind in Abbildung 1 schematisch gegenübergestellt.

Die § 35 LMBG Arbeitsgruppe „Muscheltoxine“ arbeitet seit mehreren Jahren an der Entwicklung eines standardisierten Verfahrens zur Bestimmung von PSP-Toxinen. Nach Vor-Ringversuchen mit beiden prinzipiellen Varianten wurde im Jahre 2004 eine abschließende Vergleichsstudie mit einer auf der Methode von Lawrence et al. basierenden und durch Walther [2] modifizierten Prozedur durchgeführt. Die Ergebnisse der Studie, an der zehn Laboratorien teilnahmen, erwiesen sich als sehr gut, so dass einer Aufnahme des geprüften Verfahrens in die Sammlung der amtlichen Methoden nach § 35 LMBG nichts im Wege stand.

Die Proben für den Ringversuch wurden in der Weise hergestellt, dass unbelastetes Muschelfleisch (Miesmuschel) mit einem Extrakt aus der toxischen Alge Alexandrium fundyense versetzt wurde, welches GTX-2 und GTX-3 sowie GTX-5 und Saxitoxin enthielt. Nach Extraktion mit Essigsäure und Oxidation mit Wasserstoffperoxid ergaben sich fluoreszierende Derivate, die auf einer Reversed-Phase-Säule gut trennbar und bei Extinktionswellenlänge von 330 nm und Emissionswellenlänge von 390 nm empfindlich nachzuweisen sind.

Die Nachweisgrenze der Methode liegt je nach Detektor zwischen 5 µg/kg und 50 µg/kg Muschelfleisch - in Anbetracht des EU-Grenzwertes von 800 µg/kg ein ausreichend niedriger Wert. GTX-2 und GTX-3 sind mit der Vorsäulenderivatisierung nicht zu trennen, da sie dasselbe Produkt bilden. Sollen beide Komponenten getrennt ermittelt werden, bedarf es einer Nachsäulenderivatisierung. Dies ist jedoch nur für Forschungszwecke relevant.

Bessere Ergebnisse durch automatisierte Probenvorbereitung

Das Ergebnis des Ringversuches fiel ausgesprochen positiv aus. Allerdings trat im Laufe der Homogenitätsstudie, die dem Ringversuch vorausging, und auch während des Ringversuchs selbst, bei teilnehmenden Laboratorien eine Problem auf: Die fluoreszierenden Derivate der PSP-Toxine sind thermolabil. Bereits innerhalb weniger Stunden bei Raumtemperatur nahm das FLD-Signal ab; und nach gut 24 Stunden war das Signal um bis zu 50 Prozent reduziert. Die Derivate der einzelnen PSP-Komponenten erwiesen sich zudem als unterschiedlich stabil. Das GTX-5-Derivat etwa wird erheblich stärker abgebaut als das Saxitoxin-Derivat - insbesondere bei längeren Messreihen ein nicht zu unterschätzendes Problem. Man kann ihm teilweise begegnen, indem man die Proben kühlt. Idealerweise sollte aber von der Derivatisierung bis zur Messung stets die gleiche Zeitspanne verstreichen.

Dieses Ziel lässt sich erreichen, kommen intelligente LC-Autosampler zum Einsatz. Idealerweise solche, die eine hohen Probendurchsatz garantieren, eine einfache Programmierung des Probenvorbereitungsablaufs ermöglichen und notwendige Vorbereitungsschritte wie Mischen, Temperieren oder Verdünnen beherrschen. Auf der Suche nach dem geeigneten Probengeber rückte der MultiPurposeSampler MPS 3 von Gerstel ins Blickfeld. Der MPS 3 wird über eine in die ChemStation von Agilent Technologies eingebettete einfache, aber überaus leistungsfähige Software (Gerstel-Master-Software) programmiert und gesteuert. Die erforderlichen Schritte lassen sich aus einer Liste vorgegebener Möglichkeiten, etwa MOVE, MIX oder ADD, bequem per Mausklick zusammenstellen. Die Derivatisierung von PSP-Toxinen mit dem MPS-3 gestaltet sich schließlich wie folgt:

Das mit 1 M NaOH versetzte Probenextrakt wird in den integrierten heizbaren Orbitalschüttler des MPS 3 gestellt [MOVE]. Danach wird das Derivatisierungsreagenz hinzugefügt (10%-iges H2O2) [ADD 1]. Die Probe wird 1,5 min intensiv durchmischt [MIX 1], konzentrierte Essigsäure wird hinzu gegeben [ADD 2] und danach wieder für weitere 1,5 min durchgemischt [MIX 2]. Die Oxidation stoppt, sobald der pH-Wert gesenkt wird. Der Roboterarm setzt das jeweilige Vial an seine ursprüngliche Tray-Position zurück, wo es bis zur Injektion geparkt bleibt. Exakt fünf Minuten nach Beginn der Derivatisierung wird die Probe in den LC injiziert.

Fazit: Die Proben zeigten aufgrund des reproduzierbaren Zeitablaufs erheblich bessere Korrelationskoeffizienten bei der Erstellung externer Kalibrierungen beziehungsweise geringere Standardabweichungen gegenüber einer manuellen Probenaufbereitung. Der Vergleich von zehn aufeinander folgenden Messungen an einem 1100 HPLC-System von Agilent Technologies machte deutlich: Erfolgte die Probenaufbereitung vor der Messung manuell, zeigte sich eine signifikante Abnahme der Signalintensität aufgrund der Instabilität des Oxidationsproduktes.

Bereits nach 12 Stunden (Temperatur des Autosamplers: 25 °C) wird nur noch 70% der ursprünglichen Intensität des Gonyautoxins GTX-5 gemessen. Erfolgte die Probenvorbereitung allerdings mit dem MPS 3 automatisiert und zeitlich verschachtelt, blieben Signalintensität und Messergebnisse über einen weiten Zeitraum hin konstant.

Die vorliegende Untersuchung macht deutlich: Die Zukunft der Kontrolle der Algentoxine in Muschelfleisch liegt nicht im Einsatz von Bioassays, also von Tierversuchen, sondern auf dem Gebiet der instrumentellen Analytik mittels Flüssigkeitschromatographie.

Literatur

[1] Lawrence, J.F. and Menard, C. (1991) “Liquid chromatographic determination of paralytic shellfish poisons in shellfish after prechromatographic oxidation”, J. Assoc. Off. Anal. Chem., Vol.74, no.6, 1006-1012[2] Persönliche Mitteilung von Dr. Lutz Walther, Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit

*Dr. N. Helle, Technische Lebensmittel- und Umweltanalytik (TeLA) GmbH, Fischkai 1, 27572 Bremerhaven

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