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Harnanalyse

Automatisierte Hydrolyse optimiert die Harnanalyse

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Für ihre Methodenentwicklung verwendeten Cabrices und Kollegen Stammlösungen von u.a. acht Glucuronidkonjugaten (Morphin-3-glucuronid, Oxymorphonglucuronid, Codein-6-glucuronid, Tapentadolglucuronid, Buprenorphinglucuronid, Lorazepamglucuronid und THC-COOH-Glucuronid) sowie einer Auswahl deuterierter Analoga unterschiedlicher Drogenklassen angesetzt in Methanol. Blank-Urinproben stammten von einem männlichen Freiwilligen, mit bekannten Analyten dotierte von einem forensisch-toxikologischen Labor. Die enzymatische Hydrolyse der Analyten erfolgte in einer Pufferlösung unter Einsatz von β-Glucuronidase, gewonnen aus rekombinanten Proteinen. Mit diesem Enzym habe man, wie Vergleichsuntersuchungen gezeigt hätten, die besten Umsätze erzielt, sagt Cabrices. Zudem hätten die Applikationsexperten die Injektion in das LC-MS/MS-System – anders als bislang üblich – ohne vorangeschaltetes Zentrifugieren durchführen können. Und so gingen die Applikationsexperten vor: Die Urinproben wurden vor der Analyse unter Verwendung einer Zentrifuge von störenden Partikeln befreit. Wellplatten und die Mischung aus Enzym, Hydrolysepuffer und internem Standard wurden auf dem MPS platziert. Alle weiteren Schritte, angefangen beim Mischen der Urinproben mit Enzym, Puffer und Internem Standard, anschließender 15-minütiger Inkubation und Verdünnung der hydrolysierten Probe bis zur Injektion von 2 µL der Probe in das LC-MS/MS-System erfolgten schlussendlich vollständig automatisiert.

Methode erfolgreich in die Praxis umgesetzt

Wie Cabrices und Kollegen berichten, haben sie die Entwicklung ihrer „Prep-and-Shoot“-Methode zur automatisierten Hydrolyse und quantitativen Bestimmung von Arzneimitteln und Drogen in Urin erfolgreich abgeschlossen und in die Laborroutine überführt. Ihre Methode zeichne ein schneller und einfacher Arbeitsablauf und eine hohe Robustheit und Sensitivität sowie ein hoher Durchsatz von mehr als 200 Proben in 24 h aus. Die Mischung von Hydrolysepuffer, internem Standard und β-Glucuronidase wurde optimiert, um die automatisierte Urinhydrolyse ausführen zu können, mit dem Ergebnis einer sehr guten Hydrolyseleistung bei einer Inkubationszeit von nur 15 min. Bei den Glucuroniden habe die Hydrolyseleistung zwischen 94,4 % (THC-COOH-Glucuronid) und 99,7 % (Morphin-3-glucuronid) gelegen. Ferner habe es die Kombination der LC-MS/MS-Analysebedingungen, ultrareiner β-Glucuronidase und dem Design der Ionisierungsquelle des Massenspektrometers möglich gemacht, mehr als 960 Urinproben automatisch zu hydrolysieren, zu verdünnen, zu injizieren und zu analysieren, ohne die analytische Säule zu ersetzen.

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