Automatisierte Probenvorbereitung Bestimmung natürlicher und synthetischer Steroide in Tierurin

Nicht selten wird in der Tiermast auf verbotene Substanzen wie Steroide zurückgegriffen, um schnelleren Fleischaufbau zu erreichen. Lesen Sie, wie mit einer automatisierten Festphasenextraktion ein deutlicher Effizienzgewinn bei deren Analyse erzielt werden kann.

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Der Nationale Rückstandskontrollplan (NRKP) für Lebensmittel tierischen Ursprungs ist ein Programm zum vorbeugenden gesundheitlichen Verbraucherschutz, das seit 1989 EU-weit nach einheitlichen Maßstäben durchgeführt wird. In dessen Rahmen werden unter anderem auch lebende Nutztiere auf Rückstände von unerwünschten Stoffen untersucht. Das CVUA-MEL überprüft in diesem Zusammenhang regelmäßig Urinproben von Tieren auf Steroide. „Der Einsatz dieser Substanzen als Masthilfsmittel ist in der EU verboten. Synthetische Steroide müssen daher im Urin selbst in sehr geringen Konzentrationen nachgewiesen werden“, erläutert Dr. Thorsten Bernsmann, Fachbereichsleiter am CVUA-MEL. „Für die einzelnen Substanzen dieser Stoffgruppe sind Mindestnachweisgrenzen, das heißt eine so genannte ‚recommended concentration‘ von 1 µg/l Urin vorgeschrieben.“ Um diese sehr geringen Nachweisgrenzen zu erreichen, ist es notwendig, vor der Analytik eine Probenvorbereitung durchzuführen.

Aufwändige manuelle Aufreinigung

Die Probenvorbereitung bei der Bestimmung von Steroiden in Tierurin gestaltet sich aufwändig, da zwei Festphasenextraktionen nacheinander durchgeführt werden müssen: Die Urinproben werden zunächst zentrifugiert, um feste Verunreinigungen abzutrennen. Anschließend wird mittels eines Puffers der pH-Wert auf etwa 5 eingestellt, um die Proben enzymatisch mittels Glucuronidase beziehungsweise Arylsulfatase zu hydrolysieren. Durch die Hydrolyse werden zum Beispiel die an Zucker gebundenen Steroide in ihre freie Form überführt, sodass sie bei der abschließenden Messung erfasst werden können. „Die erste Aufreinigung des hydrolysierten Probenextraktes, bei der es sich um eine retentive Festphasenextraktion handelt, erfolgt mit einer C18-SPE-Säule. Gewaschen wird mit 5%-iger Methanollösung, eluiert wird mit reinem Methanol, wobei der erste Milliliter verworfen wird. Die zweite Aufreinigung erfolgt mittels einer NH₂-SPE-Säule. Dabei handelt es sich um eine nicht-retentive Festphasenextraktion“, erklärt Dr. Bernsmann. Die Eluate werden aufgefangen, am Evaporator eingedampft, mit Lösungsmittel rückgelöst und anschließend gemessen.

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„Bis Anfang 2015 haben wir die beschriebene Aufreinigung am CVUA-MEL manuell durchgeführt, was sehr zeitaufwändig war: Für circa 24 Proben ist ein Mitarbeiter einen ganzen Arbeitstag beschäftigt“, erläutert Dr. Bernsmann. Die Proben verhalten sich auf den SPE-Säulen oft unterschiedlich, weil sie beispielsweise verschiedene Viskositäten aufweisen. „Bei der händischen Aufarbeitung können die Mitarbeiter den Unterdruck zwar regulieren, sie müssen dabei aber auf jede Probe einzeln achten, da mehrere Proben gleichzeitig bearbeitet werden“, so der Wissenschaftler. „Während eine Probe nur langsam durch die SPE-Säule läuft und etwas Unterdruck benötigt, läuft die andere leicht durch und ein Trockenlaufen dieser Säule muss verhindert werden.“

Software ermöglicht einfache Methodenerstellung

Seit Februar 2015 stellt das CVUA-MEL die aufwändigsten bislang manuell durchgeführten Methoden auf die automatisierte Probenvorbereitung mit dem Freestyle-System von LCTech um, darunter auch die Analyse von Urinproben auf Steroide. Die Software des modularen Robotikgeräts wurde für diese spezielle Probenvorbereitung eigens angepasst: „Die Besonderheit lag darin, zwei Festphasenextraktionen nacheinander bei Verwendung verschiedener Säulenformate in einer Methode zu integrieren („Dual-SPE“)“, erklärt Dipl.-Ing. Sebastian Wierer, Verfahrensentwickler bei LCTech. „Zu diesem Zweck haben wir für die Software des Systems eine spezielle Erweiterung entwickelt, die die kombinierte Bearbeitung zweier Säulen innerhalb einer Methode erlaubt.“ Dank dieser Modifikation kann die Bearbeitungsmethode für die „Dual-SPE“ in der Software ganz einfach erstellt werden: „In einem speziellen Softwarefenster sind alle Parameter, die für die Bearbeitungsschritte benötigt werden, hinterlegt. Durch Anklicken werden die Bearbeitungsschritte ausgewählt, die Parameter wie beispielsweise Flussrate und Druck eingegeben, und so die Methode definiert“, sagt Wierer. Sobald die Methode abgespeichert ist, lässt sie sich jederzeit in der Laborroutine aufrufen und nutzen.

Als SPE-Säulen setzt das CVUA-MEL für diese Probenvorbereitung die Chromabond-Modelle von Macherey-Nagel ein, um die Proben effektiv und schnell aufzureinigen: „Die Säulen können sowohl für die systematische Methodenentwicklung in der Probenvorbereitung als auch für die standardisierte Routine-Aufreinigung regelmäßiger Probenaufkommen mittels Freestyle sehr gut eingesetzt werden“, erklärt Dr. Hans Rainer Wollseifen, Applikationsspezialist bei Macherey-Nagel. Das Grundmaterial sorgt dabei für eine effiziente Anreicherung und ein ideales Fließverhalten, die optimierte Porenstruktur und hohe spezifische Oberfläche sind unter anderem für einen geringen Lösungsmittelverbrauch verantwortlich.

„Um die Flussraten zu erhöhen und Totvolumina in den Säulen zu minimieren, haben wir spezielle Plunger entwickelt, die in die Chromabond-Säulen gesteckt werden“, so Wierer. „Ohne die Plunger müsste bei höheren Flussraten oft gewartet werden, bis der Säulenbettüberstand abgetropft ist. Nun jedoch können die Konditionierungs-, Wasch- und Elutionslösungen mit konstantem Druck über die Säule gegeben werden.“

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