KOPPLUNGSMETHODEN Bestimmung von Fettsäure-Methylestern mit Ultra-Fast-GC

Die Analyse von Fettsäuren wird weltweit in großem Umfang durchgeführt. Hier wird eine Methode beschrieben, die die Analyse um das bis zu 20-fache verkürzt.

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Die Analyse von Fettsäuren wird weltweit in großem Umfang durchgeführt, um direkte Informationen über die Zusammensetzung von Fetten in verschiedensten Lebensmitteln zu erhalten. Üblicherweise wird diese Analyse nach Derivatisierung der freien Fettsäuren in ihre korrespondierenden Methylester (FAME) mittels GC durchgeführt. Bei Verwendung konventioneller Methoden dauert eine solche GC-Analyse etwa 30 bis 60 Minuten. Hier wird eine Methode beschrieben, die die Analyse um das bis zu 20-fache verkürzt.

Für ein gegebenes Produkt ist das Verteilungsmuster der Fettsäuren eine Art individueller Fingerabdruck, der in der Qualitätskontrolle u.a. zur Bestimmung der Alterung des Produktes gemessen wird. In dieser Arbeit wird eine Methode zur Bestimmung der Fame mit dem Trace GC Ultra von Thermo Electron beschrieben, der mit einer Ultra-Fast-Option ausgestattet ist (s. Abb. 1). Durch diese Technik werden extrem hohe Heizraten sowie drastisch verkürzte Abkühlzeiten möglich. Der resultierende Analysenzyklus dauert so nur noch wenige Minuten. Verglichen mit einer konventionellen GC-Analytik kann die Analyse so bis um das 20-fache verkürzt werden. Die analytische Leistungsfähigkeit der Methode wird unter Verwendung von Standardgemischen und von Extrakten aus Realproben demonstriert. Bei allen Analysen kann eine gute Übereinstimmung mit den Ergebnissen aus konventionellen GC-Analysen gezeigt werden.

Gerätekonfiguration

Für diese Applikation wurde ein TRACE GC Ultra der Firma Thermo Electron verwendet, der mit einem Split/Splitlos-Injektor, einem Ultra-Fast-Modul sowie einem schnellen Flammenionisations-Detektor ausgestattet war. Der Detektor erlaubt Aufnahmefrequenzen von bis zu 300 Hz bei einer Zeitkonstanten von nur 6 ms. Aufgrund der für diese Art der Chromatographie typischen extrem schmalen GC-Peaks (Halbwert-Breite von ca. 100 ms) werden hohe Datenaufnahmeraten benötigt, um eine ausreichende Auflösung von mindestens 15-20 Datenpunkten pro Peak zu erreichen [2].

Das Ultra-Fast-Modul (UFM) enthält die Trennsäule und wird als austauschbares Zubehör an den S/SL-Injektor sowie an den Detektor angeschlossen. Die Steuerung erfolgt direkt und vollständig über die Elektronik des GC und dessen Schnittstellen. Derselbe GC wurde nach Entfernen des Ultra-Fast-Moduls zur konventionellen Durchführung der Applikation verwendet. Die Proben wurden mit dem TriPlus-Autosampler (s. Abb. 2) von Thermo Electron unter Anwendung der „Liquid band formation“-Technik [3, 4] injiziert.

Diese Technik ist als voreingestellte Methode direkt in die Gerätesteuerung implementiert. Um die injizierte Flüssigkeit aufzufangen und die Verdampfung von einem eng begrenzten Bereich aus zu beginnen, wird Glaswolle im mittleren Bereich des Injektor-Liners verwendet. Darüber hinaus ist die Wolle wichtig, um die Effektivität der Säule zu erhalten, da nicht flüchtige Verbindungen, die eventuell in der Probe enthalten sind, auf der Wolle zurückgehalten werden und nicht in die Säule gelangen. Glaswolle darf natürlich nur für Proben verwendet werden, die keine thermolabilen Substanzen enthalten, deren Abbau während der Injektion durch die Glaswolle katalysiert werden könnte.

Für solche Proben steht ein spezieller Liner zur Verfügung. Der TriPlus-Autosampler wurde im so genannten „Rapide Mode” programmiert, bei dem in einer Sequenz die Schritte zur Spritzenreinigung und das Vorspülen mit der Probe bereits während der laufenden Analyse durchgeführt werden, um wertvolle Analysenzeit zu sparen.

Probenvorbereitung

Die Analyse erfordert die Umwandlung der in der fetthaltigen Probe enthaltenen Triglyceride in die entsprechenden Fettsäuremethylester durch Umesterung und die Abtrennung der Analyten durch Flüssig-Flüssig-Extraktion. Bei der Analyse von Serum sind zusätzlich vorher eine Extraktion der Fette aus dem Serum sowie eine Aufreinigung durch Dünnschichtchromatographie durchzuführen.

Analyse eines Fame-Standards

Abbildung 3 zeigt das Chromatogramm eines Fame-Standards, Konzentration: 50 ng/µL je Komponente. Die Analyse wurde auf einem UFM mit einer CarboWax-Säule von 5 m Länge, 0,1 mm ID und 0,1 µm Filmdicke durchgeführt. Temperaturprogramm: 120°C (6 sec.) mit 1.7°C/sec auf 250°C (12 sec.). Die Injektion erfolgte bei einem Splitverhältnis von 1:50 mit Wasserstoff als Trägergas und einer konstanten Flussrate von 0,8 mL/min. Injektor- und Heizblock-Temperatur wurden beide auf 250°C gesetzt. Das Injektionsvolumen betrug 1 µl. Zum Vergleich ist in Abbildung 3 zusätzlich ein Chromatogramm der gleichen Probe unter konventionellen Bedingungen dargestellt (CarboWax, 25 m x 0,25 mm ID x 0,1µm FD; Temperaturprogramm: 90°C (2 min) mit 30°C/min auf 150°C und dann mit 3°C/min auf 225°C (6 min), Gesamtlaufzeit: 35 min).

Die 17 Substanzen eluieren bei der UltraFast-Analyse innerhalb von 96 Sekunden statt in 33 Minuten bei konventioneller Technik, was einem Zeitgewinn um mehr als den Faktor 20 entspricht. Die quantitativen Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt und zeigen sowohl eine hohe Wiederfindung der Komponenten in Bezug auf die Erwartungswerte als auch eine sehr gute Wiederholbarkeit der Peakflächen und der Retentionszeiten.

Analyse von Fischöl

Unter den o.g. analytischen Bedingungen wurden Fischöl-Analysen durchgeführt. Ein entsprechendes Chromatogramm mit 12 identifizierten Komponenten ist in Abbildung 4 dargestellt.

Zur Überprüfung der Robustheit des Systems wurden nach einer Sequenz von 100 Realproben (Fischöl) fünf Injektionen des Fame-Standardgemisches unter den gleichen Bedingungen durchgeführt. Sehr gute Wiederholbarkeiten und nach wie vor gute Peakformen zeigen, dass die Effektivität der Säule auch nach Injektion einer Vielzahl matrixhaltiger Realproben erhalten bleibt. Wie erwähnt, wird diese Robustheit durch die Anwesenheit der Glaswolle im Liner erreicht, wodurch nicht flüchtige Komponenten daran gehindert werden in die Säule zu gelangen.

Analyse von Olivenöl

Diese Analyse wurde auf einem UFM mit einer CarboWax-Säule von 5 m Länge, 0,1 mm ID und 0,2 µm Filmdicke durchgeführt. Durch die größere Filmdicke besitzt diese Säule eine höhere Kapazität, als die o.g. Säule. Temperaturprogramm: 150°C (10 sec.) mit 1.7°C/sec auf 250°C (20 sec.). Die Injektion erfolgte bei einem Splitverhältnis von 1:300 mit Helium als Trägergas und einer konstanten Flussrate von 1,0 mL/min. Injektor- und Heizblock-Temperatur wurden beide auf 250°C gesetzt. Das Injektionsvolumen betrug 1 µl.

Die Referenzanalyse mittels konventioneller GC wurde auf Säule gleicher Phase, jedoch mit den folgenden Abmessungen durchgeführt: 25 m Länge, 0.25 mm ID und 0,25 µm FD. Der GC-Ofen wurde im gleichen Temperaturbereich wie oben, jedoch mit einer Heizrate von 5°C/min programmiert.

Abbildung 5 zeigt die entsprechenden Chromatogramme, während in Tabelle 2 die sehr gute Übereinstimmung der beiden Analysen dargestellt wird. Bei gleichem Ergebnis dauert die Analyse im Ultra-Fast- Modus nur 90 Sekunden, anstatt 20 Minuten für die konventionelle Analyse.

Serum-Analyse

Die Beschaffenheit der Fettsäuren im Blutserum hängt von den mit der Nahrung zugeführten Fetten ab [5]. Die Bestimmung der Fettsäure-Zusammensetzung in den Phospholipiden des Serums stellt einen guten Indikator der mittelfristigen Aufnahme von Fetten mit der Nahrung dar, wodurch z.B. Einhaltung und Effekt von Ernährungsstudien kontrolliert werden können. Die GC-Analyse nimmt bei diesen Studien einen hohen Zeitbedarf in Anspruch. Vor diesem Hintergrund stellt die Ultra-Fast-GC ein wichtiges Hilfsmittel zur Reduzierung der Analysenzeit dar.

Die Serum-Analysen wurden auf einem CarboWax-UFM von 5 m Länge, 0,1 mm ID und 0,2 µm Filmdicke durchgeführt. 2 µl Serumextrakt wurden mit einem Splitverhältnis von 1:250 injiziert. Temperaturprogramm: Von 160°C (10 sec.) mit 1.3°C/sec auf 200°C, dann mit 0.7°C/sec auf 230°C und anschließend mit 0.6°C/sec auf 250°C (60 sec.). Als Trägergas wurde Wasserstoff mit einer konstanten Flussrate von 0,2 mL/min verwendet. Abbildung 6 zeigt das Beispiel eines Ultra-Fast-Chromatogramms eines Serumextraktes mit Identifikationstabelle, in dem 12 Fames identifiziert worden sind.

Zusammenfassung

Ein mit der Ultra-Fast-Option ausgestatteter Trace GC Ultra von Thermo Electron erlaubt gegenüber konventioneller Technik eine 20-fach schnellere Bestimmung von Fettsäuremethylestern bei sehr guter Präzision in Bezug auf Peakflächen und Retentionszeiten. Anhand verschiedener Probenmatrices konnte durch die Bestimmung der Wiederholbarkeiten gezeigt werden, dass Ultra-Fast eine robuste und zuverlässige Alternative zu konventioneller GC darstellt.

HINTERGRUND

Omega 3-Fettsäuren– Wirkung auf die Gesundheit

Ein besonderes Interesse kommt den Omega-3 Fettsäuren EPA (5,8,11,14,17- Eicosapentaensäure (20:5)) und DHA (4,7,10,13,16,19-Docosahexaensäure (22:6), jeweils die cis-Formen) zu. Diese Säuren wirken sich auf vielfältige Weise positiv auf die Gesundheit des Menschen aus. Sie senken unter anderem das Risiko von Herzerkrankungen, unterstützen die Normalisierung des Blutcholesterin- und des Bluttriglyceridgehaltes sowie eine gesunde Gedächtnisfunktion.

In vielen Therapien erhalten Personen mit Herzerkrankungen diese Substanzen als pharmazeutische Produkte. Darüber hinaus weisen neuere Untersuchungen darauf hin, dass eine Omega 3-fettsäurereiche Ernährung das Risiko an Prostata- oder Brustkrebs zu erkranken senkt [1]. Nur Fisch – besonders Lachs – enthält größere Mengen an Omega 3-Fettsäuren.

Literatur

[1] H. Bartsh, et al., Carcinogenesis, 20 (1999) 2209.[2] P. Magni, R. Facchetti , D. Cavagnino and S. Trestianu, Proceedings of 25th International Symposium of Capillary Chromatography, KNL05, Riva del Garda, Italy, May 13-17, 2002, ed. P. Sandra.[3] F. Munari, S. Trestianu in Proc. 4th Int. Symp. Capillary Chromatography, Hindelang Germany, R. E. Kaiser (ed), Hüthig, Heidelberg, 1981, p. 349.[4] K. Grob, M. Biedermann, J.Chromatogr. A, 2000, 897, 237-246.[5] P. Avons, Markers of the Dietary Supply of Fatty Acids. Their Use in Epidemiologic Surveys. Rev Epidemiol Sante Publique, 1985; 33 (4-5): 312-23.

*R. Faccetti, A. Cadoppi, Thermo Electron, Rodano/Mailand, Italien **Klaus Schrickel, Thermo Electron,63303 Dreieich

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