LEBENSMITTELANALYTIK Bestimmung von Pestizidrückständen durch LC/MS/MS

Das Büro für Lebensmittel- und Veterinärmedizin (FVO) der Europäischen Kommission hat einen Bericht über Pestizidrückstände in 46000 Proben von Früchten, Gemüse und Getreiden [1]. In 37 Prozent der Proben wurden Rückstände gefunden, bei 3,6% der Proben lagen sie über den in der Gemeinschaft verbindlichen maximalen Rückstandsmengen.

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Das Büro für Lebensmittel- und Veterinärmedizin (FVO) der Europäischen Kommission hat einen Bericht über Pestizidrückstände in 46 000 Proben von Früchten, Gemüse und Getreiden [1].In 37 Prozent der Proben wurden Rückstände gefunden, bei 3,6% der Proben lagen sie über den in der Gemeinschaft verbindlichen maximalen Rückstandsmengen.

Im Vergleich zu den Vorjahren ist die Zahl der Proben ohne nachweisbare Rückstände leicht zurückgegangen, während der Prozentsatz von Proben mit Rückstandsmengen um oder unter der zulässigen Rückstandsmenge gestiegen ist. Dies steht vermutlich mit der Verbesserung der Analysetechniken in Zusammenhang. In der vorliegenden Studie werden Proben von Weizen und Heu als Indikatoren für Bodenkontamination betrachtet. Derartige Matrices gelten allgemein als extrem schwierig. Insofern stellen sie einen guten Test für die Empfindlichkeit, Selektivität und Robustheit einer instrumentellen Methode dar. Es werden die Auswirkungen der Matrix auf die Empfindlichkeit und Robustheit der Methode an 7 Pestiziden untersucht.

Vorgehensweise und AnalysedurchführungEine zuvor auf einem Waters Quattro Micro Triple-Quadrupol Massenspektrometer entwickelte Methode [2,3] zum Nachweis multipler Rückstände wurde auf das nachweisempfindlichere Quattro Premier Triple-Quadrupol MS übertragen.

-Probenvorbereitung: 10 g der Probe (Weizenheu und Weizenkorn) werden in einem ASE 200 System mit Aceton extrahiert. 40 mL Wasser wird hinzugefügt, dann folgt eine Flüssig-Flüssig-Extraktion mit Dichlormethan. Nach der Evaporation wird die Probe auf einer Envirogel-Säule (Aliquot 2/3) aufgereinigt. Die Probe wird getrocknet und anschließend in 2 mL Wasser/Methanol (80/20) gelöst. Jeder Extrakt wird zum Abschluss durch ein 0,45 µm Filter filtriert.

-Analysesystem: Verwendet wird eine Gradienten-HPLC (Waters Alliance), gekoppelt an ein Waters Quattro Premier Massenspektrometer, das mit MassLynx 4.0 Software gesteuert wird (Chromatographische Bedingungen: Waters Atlantis C18 4,6 x 100 mm Säule, 3 µm. Flussrate 1,0 mL/min. Gradient von 0% A ?(MeOH/H2O (1:4) + 5mM Ammoniumacetat) auf 100% B (MeOH/H2O (9:1) + 5mM Ammoniumacetat) in ?15 Minuten [2]).

-Massenspektrometrie: Die Analyse der Standards wird ausgehend von der früher veröffentlichten Nachweismethode für multiple Rückstände optimiert [2].

-Empfindlichkeit und Linearität: Es werden reine Standards und matrixabgeglichene Standards (Weizen und Heu), die alle sieben Pestizide enthalten, mit Pestizid-Konzentrationen von 0,005, 0,02, 0,05 und 0,1 pg/µL (entsprechend 0,003, 0,012, 0,03 und 0,06 µg/kg Niveau) analysiert. Standards und Probenanalysen werden dupliziert. Am Beginn und Ende jeder Sequenz werden Leerproben (Blanks) eingefügt. Robustheit der Methode: Über einen Zeitraum von 48 Stunden werden im Wechsel jeweils 48 der 0,06 µg/kg Matrixproben und Standards injiziert. Insgesamt erfolgen 96 Injektionen.

Ergebnisse - Empfindlichkeit und Selektivität

Abb. 1 zeigt das Chromatogramm für den Standard mit der höchsten Konzentration (0,06 µg/kg) der 7 Pestizide. Das Signal-Rausch-Verhältnis (Peak zu Peak) liegt für alle Analyten über 50:1, sodass eine Quantifizierung weit unter den zulässigen EU-Rückstandsgrenzen möglich ist. Abb. 2 zeigt ein Overlay der Methomyl-Standards. In Lösungsmittel und Korn-Matrix vorgenommene Kalibrierungen zeigten weder Interferenzen noch Empfindlichkeitsverlust aufgrund der Matrix. Abbildung 3 zeigt eine Injektion von 50 fg Metsulfuron-Methyl on-column nahe der Bestimmungsgrenze (LoQ). Die Heu-Matrix ist wesentlich komplexer als die Korn-Matrix und beeinflusst bekannterweise erheblich die Ionisierung und daraus folgend die Empfindlichkeit. Beim Quattro Premier beobachteten wir derartige Effekte nicht. Abb. 4 vergleicht TIC, SIR und MRM-Signale und zeigt die mit MRM erzielte Selektivität und Empfindlichkeit.

Ergebnisse - Reproduzierbarkeit und Robustheit

Um die Robustheit des Analysesystems zu bestimmen, wurden über 48 Stunden im Wechsel jeweils 48 Standards und aufgestockte Heuextrakte injiziert. Dabei kam der 0,06 µg/kg Heuextrakt zur Verwendung. Abbildung 5 zeigt den für Methomyl erzielten Stabilitätsgraphen. Die berechneten Standardabweichungen für Standard und Heumatrix-Extrakte betrugen 2,7 Prozent bzw. 3,5 Prozent.

Schlussfolgerungen: Die Empfindlichkeitsmatrizen und die Gesamtperformance des Analysesystems wurden auch durch Injektionen von verunreinigter Matrices über lange Zeiträume hinweg nicht beeinträchtigt. Die Nachweisgrenzen („Limit of Detection“, LoD) liegen weit unter den Anforderungen der Europäischen Union und erlauben eine routinemäßige quantitative Bestimmung auf einem Niveau von 0,005 µg/kg.

Nachgefragt: LC /MS /MS, selektiver und empfindlicher ?

2D-Messmethoden wie die LC/MS/MS werden immer wichtiger für die Analytik. Ihr erhöhter Informationsgehalt bietet dem Anwender große Vorteile. Dr. Marcus Winkler, Leiter der Applikationsgruppebei der Waters GmbH, erläutert LaborPraxis, warum das so ist.

LaborPraxis: Im vorliegenden Beispiel setzen Sie die LC/MS/MS ein. Welche Vorteile erzielen Sie hiermit?Winkler: Die Analytik mit LC/MS/MS bietet eine Reihe von Vorteilen gegenüber den klassischen Methoden der GC, GC/MS und HPLC. Dabei zeigt sich, dass gegenüber der GC insbesondere bei der Analytikvon polaren Verbindungen auf eineDerivatisierung ohne Verlust der Empfindlichkeit verzichtet werden kann, was die Probenvorbereitung vereinfacht.Auchdie Erfordernis aufwendiger Probenaufreinigungsschrittekann aufgrund der ausgezeichneten Selektivität der Methodik minimiert werden. Klassische HPLC Detektoren wie UV zeigen im Allgemeinen eine geringere Empfindlichkeit als MS/MS-Methoden.Sowohl die Selektivität als auch die Empfindlichkeit sind wesentliche Anforderungen der Lebensmittelanalytik und damit erfüllt LC/MS/MS diese Erfordernisse in idealer Weise.

LaborPraxis: Warum ist die MS/MS die derzeit wichtigste 2D-Kopplungsmethode?Winkler: Die Weiterentwicklung von Kopplungstechniken Mitte der 90er Jahre hatte zur Folge, dass LC/MS eine immer robustere Methode geworden ist. Bei der Analytik komplexer Matrices stellt man allerdings fest, dass die Selektivität einfacher Single-MS Systeme nicht ausreicht und die Bestimmung häufig gestörtist. Hier bietet die MS/MS-Technologie enorme Vorteile aufgrund der gesteigerten Selektivität durch den zweiten MS-Schritt. Dadurch wird bei geeigneter Wahl von Auflösung und MS/MSÜbergang der Einfluss von Störsignalen weitestgehend eliminiert. Darüber hinaus lassen sich mit Hilfe von MS/MS zusätzlicheInformationen generieren, die neben der sicheren Quantifizierung auch die qualitative Absicherung der Befunde, insbesondere bei der Analytik verbotener Stoffe, in einem Lauf ermöglicht.

LaborPraxis: Empfindlichkeit, Selektivität – welchen Nutzen hat der Anwender durch den Einsatz des Quattro Premier?Winkler: Es gibt einige wesentliche Vorteile des Quattro Premiers für die Lebensmittelanalytik. So ist die Forderung nach immer niedrigeren Nachweisgrenzen insbesondere für verbotene Stoffe nur mit Gerätender neuen Generation wie dem Quattro Premier zu erfüllen. Die Tendenz zu Screeningmethoden mit immer größerer Anzahl von Analyten in einem Lauf erfordert immer schneller messende Systeme. Durch Einsatz der patentierten T-Wave Technologie ist keine Abnahme der Signalintensitäten bis zu einer Messzeitvon 10 ms feststellbar, was das Quattro Premier zur idealen Lösung für den Screeningbereich macht. Darüber hinaus ist das Umschalten zwischen dem positiven und negativen Modus innerhalb von 20ms möglich, was kein anderes System auf dem Markt beherrscht, sodass nun Screeningmethodenmit positiv und negativ zu messenden Substanzen möglich sind. Auch für schnelle Chromatographie, insbesondere mit dem neu entwickelten Acquity UPLC System von Waters, sind diese kurzen Messzeiten von Vorteil. Die Flexibilität des Systems wird durch Ionisierungsquellen erhöht, die unterschiedlicheTechniken der Ionisierung in einem Lauf ermöglichen (ESCI und APPI/APCI).

*M. Winkler, Waters GmbH, 65760 Eschborn **F. Grisel, G. Bondoux, Waters Corporation European Headquarters, 78280 Guyancourt, Frankreich***O. Denny, A. Jenny, Laboratoire Anadiag, Haguenau, Frankreich

Literatur:[1] Europäische Kommission, Bericht “Monitoring of Pesticide Residues in Products of Plant Origin in the European Union, Nor-way, Iceland and Liechtenstein”, Bericht 2001, veröffentlicht im März 2003.[2] A Multi-Residue HPLC/MS/MS Method for the Determination of 81 Pesticides Residues in Fruits and Vegetables: Part 1, Method Overview. Gordon Kearney, Lutz Alder, Anthony Newton, Jeannette Klein. WatersApplication Note, 2003.[3] The Confirmation of the Presence of Incurred Pesticide Residues Detected usingaMulti Residue SurveillanceMethod to screen for 81 Target Analytes. Gordon Kearney, Lutz Alder, Anthony Newton, Jeannette Klein. Waters Application Note, 2003.

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