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Lichtmikroskopie

Blick in die Unterwasserwelt: Gewässeranalyse per Lichtmikroskopie

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Beispiel Flusshygiene: Das Gewässer-Monitoring

Für die routinemäßige Gewässeruntersuchung werden – neben allgemeinen abiotischen Werten wie Temperatur, Leitfähigkeit und pH-Wert und biotischen Parametern wie Chlorophyll-Werte – auch die Abundanz und Diversität von Protisten mithilfe von einfach zu bedienenden Lichtmikroskopen lebend bestimmt. Es werden vorzugsweise Mikroskope verwendet, die leicht an die jeweiligen Probenentnahmeorte transportiert werden können.

Solche Untersuchungen erfolgen u.a. im Rahmen des „Flusshygiene“ – Verbundvorhabens („ReWaM“ – Regionales Wasserressourcen-Management für den nachhaltigen Gewässerschutz in Deutschland, gefördert vom Bundesministerium für Bildung und Forschung BMBF), innerhalb dessen Probenahmen bundesweit an verschiedenen Fließgewässern (Spree-Havel-System in Berlin, Ruhr in Nordrhein-Westfalen, Rhein und Mosel in Rheinland-Pfalz sowie Isar und Ilz in Bayern) durchgeführt werden. Im Berliner Stadtgebiet (Spree-Havel-System) werden Beprobungen u.a. in Zusammenarbeit mit Wasserforschungsinstituten, den betroffenen Gesundheits- und Umweltbehörden, sowie den Wasserver- und Abwasserentsorgungsbetrieben durchgeführt. Ziel des „Flusshygiene“-Verbundvorhabens ist es, erweiterte Erkenntnisse über Eintrag und Dynamik hygienischer Belastungen in Fließgewässern zu erlangen.

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Probenahme, Präparations- und Bestimmungstechnik

Methodisch wird bei der Lebenduntersuchung von Protisten so vorgegangen, dass an den jeweiligen Gewässern Wasserproben mit einem Ruttner-Schöpfer genommen werden (z.B. drei Replikate à 100 ml ungefiltertes Wasser für die Analyse der heterotrophen Flagellaten). Diese werden anschließend gekühlt und vor Licht geschützt bis zur mikroskopischen Lebenduntersuchung aufbewahrt. Diese Lebendanalyse sollte so schnell wie möglich innerhalb einer Stunde nach Probenahme erfolgen, um das Risiko des Absterbens sowie mögliche Interaktionen der Organismen so gering wie möglich zu halten. Zur mikroskopischen Bestimmung werden daraufhin z.B. jeweils mehrere Parallelen einer 5 bis 10 μl-Wasserprobe auf einen Objektträger gegeben. Zwei Deckgläser links und rechts daneben sowie ein drittes Deckglas auf dem Tropfen verhindern ein Zerdrücken der Organismen. Die heterotrophen Flagellaten werden mit 200- bis 400-facher Vergrößerung und unter Zuhilfenahme des Phasenkontrastes lebend untersucht (s. Abb. 2). Der Phasenkontrast ist unerlässlich für die Erkennung von Geißelform, -bewegung und sonstigen speziellen Zellbestandteilen (Kragen, Lorica, Ejektisomen etc.). Bei der Bestimmung der Flagellaten wird auf spezielle Bestimmungsliteratur zurückgegriffen (z.B. [5]).

Anschließend werden die bestimmten Protistenzahlen auf einen Milliliter hochgerechnet, um Abundanzen und Diversität abschätzen zu können. Anhand der gefundenen Flagellatengruppen können Rückschlüsse auf die Elimination bezüglich pathogener Keime getroffen werden. Manche Organismen (z.B. Kinetoplastiden) nehmen weniger Bakterien pro Zeiteinheit auf als andere (z.B. Choanoflagellaten mit ihrer starken Strudelbewegung und recht großem Kragen, vgl. [3] für die äußerlichen Unterschiede).

Lichtmikroskopische Gewässer­untersuchungen von lebenden Einzellern können durch Bestimmung von Abundanzen, Biovolumina, jeweiligen Fraßtypen und unter zur Hilfenahme von abiotischen und biotischen Parametern und Bakterienabundanzen erste Näherungswerte zur Abschätzung von bakterieller Konsumption/Protisten-Grazing im jeweils untersuchten Gewässer bieten. Diese Konsumptionsraten bieten die Möglichkeit, Handlungsempfehlungen zur Förderung der gewässerinternen Eliminationsleistung für potenzielle Krankheitskeime aufzustellen, die dann auch auf andere Gewässertypen übertragbar sein können.

Je mehr gelöstes organisches Material (DOM) und Bakterien sich in einem Gewässer befinden und/oder von außen z.B. durch Starkregenereignisse und dadurch bedingte überlaufende Kanalisationen in ein Gewässer eingetragen werden, desto mehr Protisten können teilweise nachgewiesen werden. Protisten ernähren sich von Bakterien, die wiederum DOM aufnehmen. Unter Einsatz von einfacher, routinemäßig nutzbarer Optik können diese kleinen, in ihrer ökologischen und evolutionären Bedeutung stark unterschätzen Organismen schnell bestimmt und gezählt werden. Durch die Nutzung von leicht zu bedienenden Lichtmikroskopen können wichtige Aussagen über die Güte von Gewässern getroffen und neue Erkenntnisse für potenzielle Maßnahmen zu ihrer Verbesserung gewonnen werden.

Empfohlene mikroskopische Ausrüstung

Die typischen Kontrastverfahren am Mikroskop für aquatische Organismen sind Hellfeld, Phasenkontrast und Dunkelfeld. Mit Zeiss Axio Lab.A1 und einem achromatisch-aplanatischen Universalkondensor können diese leicht eingestellt werden. Die Größe der Protisten liegt zwischen 1 und 150 μm und kann daher gut mit 10x, 20x und 40x-Objektiven erfasst werden. Um die Protistenmerkmale gut bestimmen zu können, ist auf eine gute optische Korrektur (z.B. N-Achroplan-Objektive) zu achten. Phasenkontrast ist essenziell in der Charakterisierung, werden doch die Zellbestandteile visualisiert.

Mit dem Differentiellen Interferenzkontrast (DIC) kann man noch tiefere Einblicke in das Zellinnere gewinnen, da auch feine Zellbestandteile kontrastiert werden können. Dieses Verfahren ist besonders für die Untersuchung der größeren Wimpertiere und Amöben geeignet.

Literatur:

[1] Arndt, H., Dietrich, D., Auer, B., Cleven, E., Gräfenhan, T., Weitere, M., Mylnikov, A. (2000) Functional Diversity of Het-erotrophic Flagellates in Aquatic Ecosystems. In LeadbeaterBSC, Green JC (eds) The Flagellates. Taylor & Francis, London, 240 – 268.

[2] Azam, F., Fenchel, T., Field, J. G., Gray, J. S.,Meyer-Reil, L. A., Thingstad, F. (1983) The ecological role of water-column microbes in the sea. Marine Ecology Progress Series 10: 257 – 263.

[3] Boenigk, J., Arndt, H. (2000) Comparative studies on the feeding behavior of two heterotrophic nanoflagellates: the filter-feeding choanoflagellate Monosiga ovata and the raptorial-feeding kinetoplastid Rhynchomonas nasuta. Aquatic Microbial Ecology 22: 243 – 249.

[4] Deng, L., Krauss, S., Feichtmayer, .J, Hofmann, R., Arndt, H., Griebler, C. (2014) Grazing of heterotrophic flagellates on viruses driven by feeding behaviour. Environmental Microbiology Series 6: 325 – 330.

[5] Jeuck, A., Arndt, H. (2013) A short guide to common heterotrophic flagellates of freshwater habitats based on the morphology of living organisms. Protist 164: 842 – 860.

[6] Richter, D. J., King, N. (2013) The genomic and cellular foundations of animal origins. Annual Review of Genetics 47: 509 – 537.

* Dr. A. Jeuck, Prof. Dr. H. Arndt: Allgemeine Ökologie, Institut für Zoologie, Universität zu Köln 50674 Köln

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