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HPLC

Der Einfluss der Kapillaren auf die Trennung in der HPLC

| Autor / Redakteur: Werner Röpke* / Dr. Ilka Ottleben

Abb. 1: Für optimale Trennleistungen müssen auch Verbindungen und Kapilllare an das jeweilige HPLC-System angepasst werden.
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Abb. 1: Für optimale Trennleistungen müssen auch Verbindungen und Kapilllare an das jeweilige HPLC-System angepasst werden. (Bild: IDEX Health & Science)

Die beste Trennleistung einer HPLC-Säule ist wenig wert, wenn im Rahmen der HPLC ungeeignete Verbindungen oder Kapillaren verwendet werden. Der Effekt der resultierenden Peakverbreiterung ist sogar umso größer, je dünner die verwendete Säule ist.

Eine gute Trennleistung einer HPLC-Säule ist wichtige Voraussetzung für eine erfolgreiche HPLC-Trennung – jedoch keinesfalls die einzige. Ungeeignete Verbindungen oder Kapillaren können zu unerwünschten Peakverbreiterungen führen und sind daher dringend zu beachten. Bei Verwendung „altmodischer“ Standard-Trennsäulen mit 4,6 x 250 mm ist der Effekt dieser Kapillaren und Verbindungen noch nicht sehr ausgeprägt; bei dünnen Säulen wie 2,0 x 100 mm ist der Effekt dagegen schon groß.

Für diese „Ex-Column“-Peakverbreiterung sind als Hauptursache falsche Kapillaren und Hohlräume bei den Verbindungen verantwortlich, in denen sich die durchströmten Passagen signifikant erweitern. Grundsätzlich sind möglichst englumige und kurze Verbindungen anzustreben.

Verwendet der Anwender einen Geräteturm von einem einzigen Hersteller oder eine Kompakt-HPLC, sind alle Verbindungen bereits von Haus aus optimiert. Probleme treten in diesem Fall erst auf, wenn zum Beispiel ein Fremddetektor eingebunden werden soll oder die HPLC aus verschiedenen Komponenten neu zusammengestellt wird.

Die Breite eines Peaks nach der Säule ist direkt proportional zu den Säulendimensionen oder vereinfacht gesagt: Dünne Säulen produzieren schmale Peaks. Die Peakverbreiterung in den Leitungen ist also immer relativ zum gesamten System zu sehen und muss aufeinander abgestimmt sein.

Poiseuillesche Flüssigkeiten

Jean Louis Léonard Marie Poiseuilles Interesse an der Physiologie des Blutkreislaufs führte ihn 1840 auch zu grundlegenden Experimenten zum Strömungsverhalten von Flüssigkeiten in engen Röhren. Es bildet sich nicht etwa eine gerade Wand aus zwischen Probe und Laufmittel, sondern eine laminare Strömung. In einem Rohr mit dem Durchmesser „dt“ (unserer HPLC-Kapillare) bilden sich Strömungen unterschiedlicher Geschwindigkeiten „u“ aus (s. Abb. 2).

Um eine Peakverbreiterung zu minimieren, müssen die Rohrdurchmesser möglichst klein gewählt werden. Die Probenmoleküle haben das Bestreben, an die Grenze des Laufmittels zu diffundieren. Gäbe es diese Diffusion nicht, wäre der Peak endlos breit, weil gemäß der Erkenntnis von Poiseuilles die Fließgeschwindigkeit an der Wand der Kapillaren gleich Null ist und somit die Probenmoleküle an dieser Stelle nur extrem langsam vorankommen. Die Diffusion sorgt dafür, dass die Moleküle von der Wand zur Mitte des Rohres wandern und somit die Peaks in endlicher Zeit und mit endlicher Breite eluieren.

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