Dichte und Viskosität für therapeutische Proteine bestimmen

Analytische Ultrazentrifugation Dichte und Viskosität für therapeutische Proteine bestimmen

24.09.2007Autor / Redakteur: Barbara Klug-Santner* / Dipl.-Chem. Marc Platthaus

Bei der Entwicklung therapeutischer Proteine kommen eine Vielzahl von Analysetechniken zum Einsatz. Die kombinierte Messung von Dichte und Viskosität ist eine Methode zur Unterstützung von Proteinstudien, die mit der analytischen Ultrazentrifugation durchgeführt werden.

Anbieter zum Thema

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In der Entwicklung von therapeutischen Proteinen ist die Aggregation ein Parameter, der sorgfältig untersucht werden muss. Er garantiert, dass die Qualität und Konsistenz von biopharmazeutischen Endprodukten den Anforderungen entsprechen [1]. Dabei wird häufig die Analytische Ultrazentrifugation (AUC) als vielseitige, biophysikalische Methode eingesetzt. Mit ihr lassen sich Sedimentations-Geschwindigkeits-Daten als eine Funktion der Zeit sammeln und so die Größe der Moleküle in einer Probe beschreiben.

Der Vorteil der Sedimentations-Geschwindigkeits-Methode gegenüber anderen analytischen Techniken besteht darin, dass die Probenuntersuchung in der unveränderten Rezeptur durchgeführt werden kann, während bei anderen analytischen Methoden wie der SEC (Größenausschluss-Chromatographie) oder der SDS-PAGE (Gel-Elektrophorese) die Probe durch Zugabe eines Puffers vorbereitet werden muss. Derart verdünnt kann es zu einem signifikanten Kontakt der Probe mit Fremdstoffen kommen. Aus diesen Gründen ergänzen die Sedimentations-Geschwindigkeits-Studien die bereits erwähnten SEC- und SDS-PAGE-Methoden und führen so zu einer besseren Charakterisierung des Proteins (zu Aussagen über dessen Homogenität bzw. über Eigenschaften in biophysikalischen Lösungen). Die Serie der mit der AUC gesammelten Konzentrationsprofile kann mit verschiedenen Software-Paketen ausgewertet werden, um die Sedimentationsmuster aller Makromoleküle in einer bestimmten Probe aufzuklären [2, 3 und 4].

Der scheinbare Sedimentationskoeffizient jedes Makromoleküls wird von der Dichte des Lösungsmittels und von der Viskosität der Lösung beeinflusst [5]. Exakte Dichte- und Viskositätswerte des Protein-Charakterisierungs-Puffers sind daher entscheidend für einen genauen Sedimentationskoeffizienten und eine richtige Dateninterpretation.

Software berechnet Dichte und Viskosität

Das Programm Sednterp [6] ist eine Standard-Software für die Berechnung der Puffer-Viskosität und -Dichte. In dieser Software basieren die Berechnungen der Dichte und der Viskosität auf standardisierten Zusammensetzungen der Pufferlösungen. In der Sednterp-Software werden Tabellen, die die Dichte von Ein-Stoff-Lösungen bei verschiedenen Konzentrationen angeben, verwendet.

Aus dieser Datenbank kann die Dichte einer Ein-Komponenten-Lösung interpoliert werden. Bestehen Pufferlösungen aus mehreren Bestandteilen, kann die Sednterp-Software nur auf Grund von Annahmen sowohl die Dichte als auch die Viskosität angeben.

Allerdings sind viele Dichte- und Viskositätswerte gebräuchlicher Protein-Charakterisierungs-Puffer (z.B. Reduktionsmittel wie Dithiothreitol oder TCEP), Netzmittel (Tween 80 oder CHAPS) und Aminosäuren (Histidin, Arginin, Glycin) nicht in der Sednterp-Datenbank aufgenommen. Daher ist diese Methode nur beschränkt anwendbar, wenn die Dichte und die Viskosität von Protein-Charakterisierungs-Puffern berechnet werden sollen. Bereits geringste Veränderungen z.B. in der Glyzerinqualität oder der Einwaage des Glyzerins wirken sich auf Dichte- und/oder Viskositätswerte aus. Diese ungenauen Werte des Protein-Charakterisierungs-Puffers führen dann zu falschen Sedimentationskoeffizienten und in weiterer Folge zu Fehlern in der Berechnung der Protein-Molekulargewichte. Darüber hinaus sind exakte Dichte- und Viskositätswerte die Voraussetzung, um zwischen Monomeren und Dimeren unterscheiden zu können.

Dichtemessung zur Unterstützung

Die Dichte und Viskosität von Lösungen kann mithilfe verschiedener Technologien bestimmt werden. Im Vergleich zu den traditionellen Methoden wie der Dichtemessung mittels Pyknometer oder Hydrostatischer Waage hat sich mittlerweile die digitale Dichtemessung, basierend auf dem Biegeschwingerprinzip, durchgesetzt. Die Viskosität kann mit einem Kapillar-Viskosimeter, Rotationsviskosimeter, Stormer Viskosimeter oder Vibrationsviskosimeter ermittelt werden. Anton Paar bietet eine Gerätekombination zur vollautomatischen kombinierten Dichte- und Viskositätsmessung an. Das System besteht aus dem Mikroviskosimeter AMVn, dem Probenwechsler SP3-V und dem Dichtemessgerät DMA 4500/DMA 5000 und wird durch die VisioLab-Software gesteuert. Für das Einfüllen und Temperieren einer Probe sowie für den Mess- und Reinigungsvorgang werden nur rund fünf Minuten benötigt. Darüber hinaus ist der geringe Probenverbrauch von Vorteil: Nur zehn Milliliter des Protein-Puffers werden für eine Messung benötigt. Die Dichte- und Viskositätswerte werden entweder ausgedruckt oder über die VisioLab-Software an einen PC bzw. an ein LIM-System gesendet.

Fazit

Die vollautomatische kombinierte Dichte- und Viskositätsmessung ist eine Methode, mit deren Hilfe Protein-Reinheit in höchster Qualität und Aggregations-Daten bestimmt werden können. Dies ist gerade für pharmazeutische Firmen – speziell im Bereich der Protein-Therapeutika – von großem Interesse.

Literatur

[1] Steven A. Berkowitz, Role of Analytical Ultracentrifugation in Assessing the Aggregation of Protein Biopharmaceuticals, The APPS Journal 2006, Vol 8, E590-E605.

[2] Peter Schuck, Sefit Version 9.3b, National Institutes of Health, 2006.

[4] B. Demeler, UltraScan: A Comprehensive Data Analysis Software Package for Analytical Ultracentrifugation Experiments. In: Modern Analytical Ultracentrifugation: Techniques and Methods. D.J. Scott, S.E. Hardingand A.J. Rowe. Eds. Royal Society of Chemistry (UK) (2005) p 210-229.

[5] Greg Ralston, Introduction to Analytical-Ultracentrifugation, Beckman Instrument, Inc. 1993, p 26.

*B. Klug-Santner, Anton Paar GmbH, 8054 Graz-Straßgang/Österreich

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