Extraktion von Aflatoxinen aus Futtermitteln und Nüssen

SPECIAL PROBENVORBEREITUNG Extraktion von Aflatoxinen aus Futtermitteln und Nüssen

02.05.2004Autor / Redakteur: Frank Höfler* / Dipl.-Chem. Marc Platthaus

Die beschleunigte Lösemittelextraktion (englisch: Accelerated Solvent Extraction: ASE) ist eine junge Extraktionstechnik, die sich durch kurze Extraktionszeiten, einen geringen Lösemittelverbrauch und einen hohen Grad der Automation auszeichnet. Die ASE kann leicht konventionelle Flüssigextraktionsverfahren ersetzen, da die gleichen Lösemittel zur Extraktion verwendet werden.

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Im Gegensatz zu konventionellen Techniken erfolgt die Extraktion bei der ASE bei erhöhten Temperaturen (20 bis 200 °C) und unter Druck (7 bis 20 MPa). Durch diese Bedingungen wird die Extraktionskinetik beschleunigt und die Lösefähigkeit des Extraktionsmittels erhöht, so dass eine typische Extraktion für eine Probe von 10 g in weniger als 15 Minuten und mit ca. 15 mL Lösemittel erfolgt. [1,2]

Die ASE etablierte sich zuerst in der Umweltanalytik. Das amerikanische Umweltbundesamt (U.S. EPA) akzeptierte die ASE als normierte Methode für die Extraktion umweltrelevanter Verbindungen aus festen Proben, noch vor Einführung kommerziell erhältlicher Systeme. Die entsprechende Methode (U.S. EPA SW 846 Methode 3545) gilt für basische, neutrale und saure Verbindungen, chlorierte Herbizide und Pestizide, Organophosphorpestizide, polychlorierte Biphenyle (PCB) und polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe (PAK) [3].

In der Lebensmittelanalytik wurde die ASE bereits für die Extraktion von Pestizidrückständen, Fetten und Aromen erfolgreich eingesetzt. Für die Pestizidrückstandsanalytik gibt es im Lebensmittel- und Bedarfsgegenstände-Gesetz Paragraph 35 (LMBG §35) ein Modul zur Probenvorbereitung, das eine ASE-Methode beschreibt. Von großem Interesse ist in der Lebensmittelkontrolle auch die Analyse von Mykotoxinen, da diese Schimmelpilzgifte zu den toxischsten Verbindungen gehören, die bisher entdeckt wurden.

Mykotoxine

Mykotoxine werden durch Schimmelpilze gebildet und können in Lebensmitteln und Tierfutter vorkommen. Sie können bei ungünstigen Lagerbedingungen wie lange Lagerzeit, hohe Feuchtigkeit und warme Lagertemperatur gebildet werden. Bisher wurden mehr als 400 unterschiedliche Mykotoxine identifiziert, die sich in ihrer Toxizität und chemischen Struktur stark unterscheiden. Zu den wichtigsten Mykotoxinen bezogen auf die Toxizität und ihre Verbreitung gehören die Aflatoxine, Vomitoxine, Fumonisine, Zeraleone und T2-Toxine. Neben einer hohen Kanzerogenität und Mutagenität bedingen Mykotoxine starke wirtschaftliche Verluste in der Tiermast. Mykotoxine können innere Organe schädigen und das Immunsystem beeinträchtigen, so dass die Tiere anfällig für Krankheiten werden.

In der Schweinemast bewirken Fumonisine im Futter eine geringere Gewichtszunahme und eine geringere Zahl an Ferkeln. Für Rinderfutter gibt es Höchstwerte für Mykotoxingehalte (Tabelle 1). Da Mykotoxine im Spurenbereich bestimmt werden müssen, ist insbesondere die Extraktion aus komplexen Matrices wie Lebens- und Futtermitteln entscheidend für die Ergebnisse der sich anschließenden Analytik. Nachfolgend wird eine effiziente Methode zur Extraktion von Aflatoxinen am Beispiel von Getreidefutter und Nüssen vorgestellt.

Extraktion von Aflatoxinen

Zur Optimierung der Extraktionsbedingungen wurden Proben von 20 g eingesetzt, die mit je 100 µg/kg der Aflatoxine G1, G2, B1 und B2 dotiert waren. Zuerst wurde als Matrix sauberer Sand eingesetzt, um die Extraktionsbedingungen und die nachfolgende Analytik ohne den Einfluss von Matrixkomponenten zu testen. Anschließend wurden Hafer- und Maisproben, die keine Mykotoxine enthielten, mit denselben Mengen an Aflatoxinen dotiert, extrahiert und analysiert.

Als Extraktionsmittel wurde Acetonitril eingesetzt, das auch mit der nachfolgenden HPLC-Trennung kompatibel ist. Die Extraktion erfolgte bei 100 bar Druck und 75°C Extraktionstemperatur. Die benötigte Zeit für eine Extraktion beträgt 17 Minuten. Die Extrakte wurden anschließend filtriert und auf ein definiertes Volumen aufgefüllt und mit HPLC und UV-Detektion analysiert. Anschließend wurde als natürlich kontaminierte Probe ein Standard-Referenzmaterial aus entfetteten Erdnüssen unter den gleichen Bedingungen extrahiert.

HPLC-Analytik

Extraktvolumen von 20 µL wurden auf eine 4,6 x 250 mm Acclaim C18 (5 µm Partikeldurchmesser) injiziert und bei 365 nm im UV/Vis detektiert. Die Gradiententrennung erfolgte mit einem Wasser-Methanol-Acetonitril-Gemisch, beginnend mit 95% Wasser, 2,5% Methanol und 2,5% Acetonitril, das in 20 Minuten auf 50% Methanol und 50% Acetonitril erhöht wurde. Die Quantifizierung erfolgte mit externen Standards bei drei unterschiedlichen Konzentrationen.

Ergebnisse

Die relativen Wiederfindungswerte der dotierten Sand-, Hafer- und Maisproben sind in Tabelle 2 aufgeführt. In Klammern ist jeweils die relative Standardabweichung, aus drei Wiederholungen angegeben, aufgeführt. Für alle Aflatoxine werden unter den gewählten Bedingungen Wiederfindungswerte zwischen 73% und 104,4% erhalten. Die relative Standardabweichung beträgt zwischen 1,3% und 11,6%. Es wird keine Matrixabhängigkeit beobachtet, das heißt, die Wiederfindungswerte für die Sandproben und die Futtermittel sind vergleichbar.

Da dotierte Proben einfacher zu extrahieren sind als natürlich kontaminierte Proben, bei denen die Analyte in die Matrix eingelagert sein können, wurde anschließend ein zertifiziertes Referenzmaterial (entfettetes Erdnussmehl) analysiert. Der Gehalt an Aflatoxin B1 war hier mit 213 µg/kg zertifiziert. Mit der ASE und nachfolgender HPLC/UV wurde ein Gehalt von 308 µg/kg bestimmt. Dies entspricht dem 1,5-fachen des zertifizierten Gehaltes. Die relative Standardabweichung für die hier vorgestellte Methode wurde durch drei Wiederholungen mit 6,6% bestimmt. Diese sehr gute Standardabweichung wird für Referenzmaterialien und sehr homogene Proben erreicht. Für typische Futter- und Lebensmittelproben ist eine Standardabweichung von 10% als gut einzustufen.

Fazit

Die „Accelerated Solvent Extraction“ eignet sich sehr gut für die effiziente Extraktion von Aflatoxinen aus Nüssen und Futtermitteln.

Dabei zeichnet sie sich durch einen geringen Lösemittelverbrauch und einen hohen Grad der Automation aus. Die Effizienz der Extraktion wird durch die erhöhte Temperatur und durch den erhöhten Druck bewirkt, der ein Sieden des Lösemittels verhindert und weiterhin einen besseren Kontakt zwischen Extraktionsmittel und Probe ermöglicht.

*F. Höfler, Dionex (Europe) Management AG, 4600 Olten, Schweiz

Literatur[1] F. Höfler, LaborPraxis 3, 62-67 (1995)[2] F. Höfler, LaborPraxis 4, 58-62 (1995)[3] Test Methods for Evaluating Solid Waste, Method 3545, USEPA SW-846, 3rd ed., Update III, U.S. GPO, Washington, DC, 1997

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