Fluoreszenzmikroskopie analysiert zelluläre Proteinverteilung

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Ruprecht-Karls-Universität Kirchhoff-institut für Physik

Allerdings ist die Anzahl der in einem Beugungsscheibchen befindlichen Biomoleküle, die aufgrund von Unterschieden im Fluoreszenzemissionsspektrum getrennt voneinander detektiert werden können, relativ gering (derzeit weniger als zehn). Über Unterschiede in Spektralfarben hinaus gibt es jedoch noch weitere Möglichkeiten, auch eng benachbarte Moleküle voneinander lichtoptisch zu unterscheiden. Beispielsweise kann man die Beugungsscheibchen von ganz eng zusammenliegenden, nur in einer einzigen Spektralfarbe leuchtenden Molekülen auch dann voneinander getrennt registrieren und damit positionieren, wenn diese Moleküle ihre Leuchtkraft zeitlich verändern; ein einmaliges Aufblitzen würde dabei genügen, wobei der Zeitpunkt des Aufblitzens die spektrale Signatur darstellt.

Auf der Grundlage des SPDM/SALM Prinzips wurden in den letzten Jahren erstmals makromolekular aufgelöste Bilder von zellulären Proteinverteilungen realisiert. Entsprechend dem Grundprinzip, nahe benachbarte Moleküle (Abstand kleiner als das Abbe-Limit) getrennt voneinander zu detektieren, wurde durch photophysikalische Vorgänge deren Fluoreszenz nacheinander an- und abgeschaltet, sodass dort zu einem bestimmten Zeitpunkt jeweils nur das Signal eines einzelnen Moleküls registriert wurde. Als makroskopisches Bild kann ein Leuchturm herangezogen werden, dessen einzelnes kurzes Aufblitzen des Leuchtsignals Schiffen bereits zur genauen Positionsbestimmung ausreicht. Und dies auch dann, wenn das Leuchtturmsignal aus weiter Ferne aufgrund der begrenzten optischen Auflösung sehr viel größer zu sein scheint; zwei sehr nahe beieinander gelegene Leuchttürme können auch bei gleicher Signalfarbe aufgrund verschiedener Zeitpunkte des Aufblitzens getrennt registriert und damit lokalisiert werden. Die Anwendung dieses Prinzips in der spektralen Lokalisationsmikroskopie erlaubte es, durch die Kombination vieler tausender von Aufnahmen derselben Zelle „Lokalisationsbilder“ von Einzelmolekülverteilungen mit wesentlich verbesserter optischer Auflösung zu gewinnen.

Abbe-Limit um den Faktor 20 unterschritten

In der Heidelberger KIP-Arbeitsgruppe konnte gezeigt werden, dass dieses Schalten zwischen einem hellen (fluoreszierenden) und einem dunklen (nicht fluoreszierenden) Zustand unter bestimmten photophysikalischen Bedingungen (hier die Beleuchtungsintensität) für viele gewöhnliche Farbstoffmoleküle realisiert werden kann, von konventionellen fluoreszierenden Proteinen bis zu weit verbreiteten Alexa- und Fluoreszeinfarbstoffen. Als Beispiel für die SPDM/SALM-Methode wird in Abbildung 1 dieselbe Zelle wie in Abbildung 3 gezeigt, diesmal aber im SPDM/SALM-Modus: Im Unterschied zum konventionellen fluoreszenzmikroskopischen Bild sind hier Histonmoleküle (rot) und Chromatinremodellierungsproteine (grün) klar voneinander unterscheidbar. Im Mittel wurden in diesen Zellkernen ca. 70 000 H2A-Moleküle und 50 000 Snf2H-Moleküle registriert. Aufgrund des verwendeten SPDM-Aufnahmeverfahrens stammen die detektierten Moleküle aus einer 600 nm dicken Kernschicht. Das Beispiel zeigt, dass das SPDM/SALM-Verfahren es ermöglicht, markierte Molekültypen in Zellen auch in großen Mengen zu bestimmen und ihre räumliche Verteilung quantitativ zu analysieren. Bei dem gegenwärtigen methodischen Stand konnten einzelne zelluläre Moleküle desselben Typs im Abstand von etwa 15 nm voneinander getrennt detektiert und ihre relative Position mit einer Genauigkeit von wenigen Nanometern bestimmt werden. Zusätzlich zu Proteinen des Zellkerns wurde das Verfahren auch bei spezifischen DNA-Sequenzen sowie auch bei Proteinen der Zellkernhülle, der Zellmembran und des Zytoplasmas erfolgreich eingesetzt.

Derzeit wird von der Heidelberger Arbeitsgruppe mit SPDM/SALM eine lichtoptische Auflösung zellulärer Nanostrukturen von etwa zehn Nanometer erreicht, bei detektierten Moleküldichten bis zu 1300 pro µm2 oder etwa 40 aufgelösten Molekülen pro Beugungsscheibchenfläche (0,1 µm Radius). Diese derzeitige Bestauflösung entspricht etwa 1/50 der eingesetzten Laserwellenlänge, oder dem Durchmesser eines einzelnen größeren Proteins, oder 1/1000 Durchmesser eines Zellkerns. Damit unterschreitet sie das Abbe-Limit um den Faktor 20. Konventionelle Fluoreszenzmikroskope können mit relativ geringem Aufwand für SPDM/SALM umgebaut werden. Das in Abbildung 4 gezeigte System wird derzeit für Anwendungen in der pharmakologischen Grundlagenforschung eingesetzt. Es ist damit zu rechnen, dass die SPDM/SALM-Techniken in der molekularen Diagnostik auf Einzelzellniveau eine weite Verbreitung erlangen und eine wesentliche Ergänzung molekularbiologischer Verfahren bilden werden.

*Institut für Pharmazie und Molekulare Biotechnologie, Universität Heidelberg, 69120 Heidelberg

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