Charakterisierung und Qualitätskontrolle von Zellsuspensionen Fluoreszenzmikroskopie: Vorteil durch Filter

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Mittels Durchflusszytometrie können Zellsuspensionen schnell charakterisiert werden. Aber nicht jeder hat die notwendige Geräteausstattung oder ausreichend Zellmaterial für diese Methode. Doch auch für diese Anwender gibt es eine Lösung – Filtermikroskopie mit automatisierter fluoreszenzmikroskopischer Auswertung.

Zur Untersuchung von Zellsuspensionen werden aktuell je nach Zielstellung unterschiedliche Methoden angewandt. Die Charakterisierung von suspendierten Zellen beispielsweise mittels Durchflusszytometrie ist eine seit Jahrzehnten bewährte Methode, sowohl in der Forschung als auch in der klinischen Diagnostik. Durchflusszytometer vereinzeln mittels hydrodynamischer Fokussierung die Zellen in einem kontinuierlichen Probenstrom. Die Zellen werden von mehreren Photodetektoren regis­triert, die Fluoreszenzfärbungen und gestreutes Licht quantitativ detektieren. Die Methode kann innerhalb kurzer Zeit extrem große Mengen von Zellen untersuchen und eine Vielzahl quantitativer Parameter ermitteln. Da die Parameter aus statistischen Untersuchungen der Photoimpulse berechnet werden, muss jedoch von jeder zu untersuchenden Zellart eine große Anzahl von Exemplaren in der Probe vorhanden sein. Gleichzeitig darf die Gesamtkonzentration von Objekten in der Probe nicht zu hoch sein.

Stand der Technik bei der Zellzählung

Stand der Technik bei Zellzählgeräten ist beispielsweise ein Coulter-Counter, der das Zellvolumen als Leitfähigkeitsänderung anhand der Verdrängung des leitfähigen Probenpuffers aus einer Kapillare de­tektiert. Der CASY-Counter misst zusätzlich die Leitfähigkeit der Zellmembran als Indikator für die Zellvitalität. Beide Verfahren sind in der Routine gut etabliert und liefern kostengünstig und schnell statistische Parameter der Probe. Komplexere Analysen oder Untersuchungen einzelner Zellen sind jedoch prinzipiell nicht möglich.

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Nucleo-Counter und ähnliche Zellzähler beruhen auf einfachen Fluoreszenzmikroskopen. Sie detektieren z.B. in einer Neubauer-Kammer DAPI-gefärbte Zellkerne und ermitteln so die Zellkonzentration. Viele dieser Systeme erfassen auch den Zelldurchmesser und eine zusätzliche Fluoreszenzfärbung, lösen jedoch keine weiteren Details der Zelle auf. Detailliertere Untersuchungen sind somit nicht möglich. Die Methode unterliegt zudem aufgrund der Größe der Zählkammern verschiedenen Beschränkungen bezüglich Zellzahl und Probenvolumen.

Was aber tun, wenn entweder die zur Durchflusszytometrie notwendige teure Geräteausstattung nicht vorhanden und unerschwinglich ist, oder aber nur sehr wenig Zellmaterial für die Analyse vorliegt und trotzdem eine detaillierte Charakterisierung der Zellen unabdingbar ist?

Filtermikroskopie ...

Dafür hat das Forschungszentrum für Medizintechnik und Biotechnologie (fzmb) eine Methode entwickelt, bei der Zellen aus einem Volumen von wenigen Mikrolitern bis mehreren Millilitern auf einer Membran abgeschieden und durch Größenausschluss oder durch antikörpervermitteltes „spezifisches Fangen“ (Immunofiltration) angereichert werden. Die Membran wird im Vorfeld für die gewünschte Applikation durch Oberflächenmodifizierung (Hydrophilisierung und Ligandenkopplung) angepasst.

Die anschließende spezifische Färbung der Zellen kann entweder vor dem Aufgeben der Zellen auf die Membran erfolgen oder aber direkt im Durchfluss. So werden Zeit und Arbeitsschritte gespart. Waschen der Membran im Durchfluss entfernt störende Begleitstoffe und Partikel und reduziert Hintergrundfluoreszenz auf ein Minimum. Da die Membran im feuchten Zustand transparent ist, kann die mikroskopische Auswertung direkt auf der Membran erfolgen. Das Mikroskopieren erfolgt automatisiert, ebenso die Auswertung.

Mit dieser Technik können schnell und zuverlässig verschiedene Qualitätskriterien, wie Expression von Oberflächenantigenen (Phänotyp) und Vitalität der Zellen (Lebend-Tod-Färbung) in einem Ansatz parallel bestimmt werden.

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