Funktion von Krebs-Stammzellen analysieren

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Die asymmetrische Mitose besitzt eine spezifische molekulare Signatur, die durch eine polarisierte dreidimensionale Verteilung bestimmter trennender Determinanten geprägt ist. Dies sind Proteine, die unter den Tochterzellen unterschiedlich verteilt werden und für das Stammzellschicksal mitentscheidend sind. Die Möglichkeit der Konfokalmikroskopie, optische Schnitte herzustellen, ist deshalb zur Rekonstruktion der volumetrischen Lokalisierung eines Polaritätsmarkers von entscheidender Bedeutung (s. Abb. 1). Die räumliche Verteilung des Polaritätsmarkers Numb (Grün: Alexa 488; Cyan: DAPI) wurde hier in normalen Stammzellen (A) sowie in Krebsstammzellen (B) analysiert. Die 3D-Projektion eines z-Stapels wurde mit einem Konfokalmikroskop Leica TCS SP2 aufgenommen. Die extrem unterschiedliche Signalverteilung der trennenden Determinante Numb in normalen Brust- (Panel A) und Krebs-Stammzellen (Panel B) bestätigte, dass die für normale Stammzellen typische asymmetrische Teilung bei der Transformation verloren geht.

Die enge Verbindung zwischen dem Schicksal von Stammzellen und ihrer physiologischen Umgebung (Stammzellnische) fordert die Abbildung von Zellen in lebenden Organismen, bzw. in fixierten dicken Gewebeschnitten, damit die native histologische Architektur beibehalten wird. Die Dicke ausgewachsener Mammosphären kann 100 µm überschreiten, was eine erhebliche Herausforderung für die herkömmliche Konfokalmikroskopie darstellt. Deshalb kommt in diesem Forschungsgebiet bei in-vivo- und in-vitro-Untersuchungen zunehmend die Zweiphotonenmikroskopie zum Einsatz.

Von der Strukturanalyse zur in-vivo-Charakterisierung

Neben der höheren Eindringtiefe der Zweiphotonenmikroskopie bietet auch der Einsatz von gepulsten Infrarotlasern Vorteile im Bereich der funktionalen mikroskopischen Assays. Die gleichzeitige Absorption zweier Photonen mit geringer Energie eröffnet die Möglichkeit, selbst in großen Gewebetiefen Fluoreszenz im UV-Bereich anzuregen. Dadurch kann die räumliche Verteilung verschiedener endogen exprimierter Stoffwechselprodukte visualisiert und quantifiziert werden. Ein Beispiel ist NADH, ein relevanter Marker für die Glykolysetätigkeit der Zelle (s. Abb. 2). Die Möglichkeit das emittierte Licht mittels Spektralanalyse zu durchsuchen, erlaubt die gleichzeitige Quantifizierung der Fluoreszenz aus verschiedenen Molekülen, die mit gleichen Wellenlängen angeregt wurden. Dies wird in Abb. 2 gezeigt, wo NADH und Flavin gemäß ihrer photophysikalischen Eigenschaften nachgewiesen wurden. Dazu wurde ein gepulster Infrarotlaser bei 740 nm Wellenlänge zur Fluoreszenzanregung endogener Moleküle in in-vitro gezüchteten Mammosphären eingesetzt. Die in der Grafik dargestellte Spektralanalyse zeigt die molekularen Quellen, die zur Erzeugung des emittierten Lichts beitragen. Die z-Stapel wurden ebenfalls mit dem Konfokalmikroskop Leica TCS SP5 aufgenommen. Die Intensitätsverteilung der 3D-Projektion zeigt NAD(P)H als grünes und Flavin als rotes Signal.

Großes Potenzial von photoaktivierbaren Proteinen

Die nichtlineare Zweiphotonenmikroskopie wird auf dem Gebiet der Stammzellbiologie zu einem wichtigen Untersuchungsinstrument für funktionelle Charakterisierungen des Selbsterneuerungspotenzials von Zellen in-vivo. In diesem Zusammenhang ist es allerdings notwendig, neue Nachweisverfahren für Stammzellen zu entwickeln, um eine größere Repräsentativität in zunehmend komplexen biologischen Umgebungen zu erreichen. Zur Abbildung der metabolischen Aktivität einer Stammzelle muss ein einzelnes Mitose-Ereignis (in normalen Mammosphären) bzw. bestenfalls einige Mitose-Ereignisse (etwa fünf in Tumorsphäroiden) [1] in einer Population von mindestens einigen Hunderten von Zellen isoliert werden.

Photoaktivierbare Markerproteine bieten in dieser Hinsicht ein enormes Potenzial. Bestimmte Varianten fluoreszierender Proteine wie beispielsweise paGFP oder pamCherry, fluoreszieren kaum in ihrer ursprünglichen Form. Beleuchtet mit spezifischen Wellenlängen durchlaufen sie jedoch eine strukturelle Modifizierung, die eine Änderung in ihrem photophysikalischen Verhalten bewirkt. Durch die enorm erhöhte Helligkeit der photokonvertierten Moleküle wird ein entsprechender optischer Kontrast erzeugt. Die für Konfokalmikroskope typische punktweise Beleuchtung erlaubt eine räumliche Auswahl der photoaktivierenden Zielbereiche. Allerdings kann mit der herkömmlichen konfokalen Beleuchtung die Photokonversion nur zweidimensional gesteuert werden.

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