Funktion von Krebs-Stammzellen analysieren

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Lokalisierung von Zellteilungen in komplexen Proben

In der konventionellen Konfokalmikroskopie werden optische Schnitte nicht von fokussierten Laserstrahlen mit Gauss’scher Strahlform per se erzeugt, sondern durch die räumliche Filterung mittels einer Lochblende. Bei der Zweiphotonenmikroskopie wird durch die nichtlineare Anregung die optisch aktive Region verkleinert. Dadurch können Photoaktivierungsprozesse in einem definierten, sehr kleinen Volumen durchgeführt werden [2]. Kombiniert mit der hohen Eindringtiefe eröffnet dies die Möglichkeit, Zellereignisse selbst in komplexen biologischen Proben sehr effizient zu lokalisieren und zu visualisieren.

Der Photoaktivierungsprozess ist reversibel und die erhöhte Fluoreszenz bleibt bis zum Proteinabbau bestehen. Erste Beobachtungen des pamCherry-H2B Histon-Fusionsproteins ergaben, dass die Aktivierung noch für mehrere Zellteilungen anhält. Die durch das Zweiphotonenverfahren induzierte Photoaktivierung kann also zur gezielten Auswahl von Zellen angewendet werden – sogar in einer neu entstehenden komplexen Struktur wie in Abb. 3 gezeigt in einer Mammosphäre. Hier wurden MCF10A-Zellen mit einer retroviralen DNS-Kodierung für das Fusionsprotein pamCherry-H2B infiziert und für dreidimensionales Wachstum kultiviert. Zur spezifischen Photoaktivierung einer gewählten Zellsubpopulation innerhalb des Sphäroids wurde ein 800 nm Infrarotlaser eingesetzt (rechts unten in Abb. 3 ein DIC-Übersichtsbild des Sphäroids). Die aktivierten Zellen wurden dann mit einer 561 nm Laserlinie abgebildet. Die erfasste Mitose belegt eine gleichmäßige Aufteilung der photoaktivierten Histone während der Zellteilung.

Durch die Kontrolle der restlichen photoaktivierten Fluoreszenz im zeitlichen Verlauf wird also eine indirekte Auswertung der proliferativen Aktivität und Selbsterneuerungskapazität der Zellen erreicht.

Literatur

[1] Cicalese A, Bonizzi G, Pasi CE, Faretta M, Ronzoni S, Giulini B, Brisken C, Minucci S, Di Fiore PP, Pelicci PG. The tumor suppressor p53 regulates polarity of self-renewing divisions in mammary stem cells. Cell, 2009 Sep 18; 138 (6): 1083-95

[2] Testa I, Parazzoli D, Barozzi S, Garrè M, Faretta M, Diaspro M. Spatial control of pa-GFP photoactivation in living cells. J Microsc. 2008 Apr; 230 (Pt1): 48-60

* L. Furia, M. Faretta: Europäisches Institut für Onkologie, IFOM-IEO-Campus, 20139 Mailand, Italien

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