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Mobile-Phase-Monitor

Ein Problem, das jeder Anwender kennt: Ist noch genügend mobile Phase für die letzten Messungen vorhanden? Die manuelle Berechnung ist zeitaufwändig. Mit dem Mobile-Phase-Monitor (MPM) wird dieses Problem technisch gelöst. Der MPM wird in der Lösungsmittelschale der UHPLC positioniert und bestimmt durch eine Waage aktiv die Lösungsmittelmengen in den einzelnen Vorratsflaschen (s. Abb. 3). Beim Starten der Batch berechnet die Software die benötigte Menge an Lösungsmittel für alle Proben sowie die Spülprozedur am Ende der Batch. Gradienten werden in dieser Berechnung auch berücksichtigt.

Ist nicht genug mobile Phase vorhanden, kann der Anwender die Messungen nicht starten bis ausreichend Laufmittel nachgefüllt ist. Diese intelligente Funktion vermeidet eine Beschädigung der Säule durch zu wenig mobile Phase, erhöht die Lebensdauer der stationären Phase und verringert so die Kosten für Verbrauchsmittel. Darüber hinaus werden Zeit und Kosten eingespart, da fehlgeschlagene Messungen nicht wiederholt werden müssen und kostbare Proben nicht verloren gehen.

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Problem Luftblasen

Die Weiterentwicklung von Degasern und effizienteren Lösungsmittelpumpen haben in der Vergangenheit dazu geführt, dass Luftblasen in modernen HPLC-Geräten deutlich seltener auftreten. Tauchen Luftblasen aber doch einmal im UHPLC-System auf, stellen sie ein großes Problem für die Reproduzierbarkeit von Messergebnissen dar. Die mobile Phase wird nicht mehr präzise gefördert, ein Abfall des Systemdrucks ist zu beobachten, die Form der Peaks verändert sich, und Retentionszeiten schwanken drastisch. Folglich müssen die Messungen, bei denen dieses Problem aufgetaucht ist, wiederholt werden.

Die Behebung dieses Problems erfordert i.d.R. eine Beobachtung der oben beschriebenen Effekte durch den Anwender und eine manuelle Einleitung von Gegenmaßnahmen. Bei einem automatisierten HPLC-System erfolgt diese Beobachtung aber meistens erst am Ende der Batch, bei der Datenauswertung. Je nach Länge der Batch und Auftreten der Luftblasen sind unter Umständen viele Stunden Messzeit und Chemikalien verbraucht worden.

An dieser Stelle setzen die Auto-Diagnose- und Auto-Widerherstellungsfunktion an, die Luftblasen im Nexera-UHPLC-System durch einen Algorithmus erkennen und sofort und automatisiert Gegenmaßnahmen einleiten, um das Problem zu lösen. (s. Abb. 4). In diesem Fall bricht der aktuelle HPLC-Lauf ab, die Lösungsmittelleitungen werden bis zum Injektions-Port gepurged und Luftblasen aus dem System entfernt. Im Anschluss wird die Säule wieder für die nächste Messung konditioniert und, wenn gewünscht, die verworfene Probe re-injiziert. In diesem Fall werden die Datenfiles versioniert, sodass die vollständige Nachverfolgbarkeit dieses Zwischenfalls gewährleistet ist.

Überlappende Peaks

Die Datenauswertung ist ein weiterer kritischer Schritt in der UHPLC-Analytik mit einigen Herausforderungen für den Anwender. Bei der Verwendung von unspezifischen Detektoren wie UV-Detektoren lässt sich nicht zwischen zwei UV-absorbierenden Verbindungen unterscheiden, wenn die Substanzen zur gleichen oder ähnlichen Zeit eluieren. Eine Identifikation dieser co-eluierenden Peaks ist in diesem Fall nur schwer möglich und eine Quantifizierung nicht umsetzbar. Ein neu entwickeltes, intelligentes Software-Tool wirkt diesen Limitierungen entgegen. Es ermöglicht, die unterschiedlichen UV-Absorptionsspektren der co-eluierenden Peaks separat darzustellen. Für diese Anwendung ist ein Photodiodenarray- Detektor (PDA) notwendig, der zu jedem Datenpunkt im Chromatogramm ein volles UV-Spektrum aufnimmt.

Mit diesem System können Anwender jedes Wissensstands die überlappenden Peaks sehr gut identifizieren und auch präzise quantifizieren. Exemplarisch für die Funktion des i-PDeA zeigt Abbildung 5 Teil A die drei Strukturisomere, o-Methylacetophenon (o-MAP), m-Methylacetophenon (M-MAP) und p-Methylacetophenon (p-MAP), die mittels RP-HPLC nur unzureichende Trennungen aufweisen. In Teil B ist zu sehen, wie die sehr großen Peaks von o-MAP (blau) und m-MAP (grün) einzeln durch die Software abgebildet sind. Zudem ist bei stärkerem Zoomen auf den pinkfarbenen Peak des p-MAP eine gaußförmige Peakform zu erkennen. Ein gutes Beispiel für die Anwendung dieser intelligenten Technik ist die Kontrolle von Syntheseprodukten auf Verunreinigungen. Teil C zeigt den Nachweis vom Nebenprodukt m-MAP (grün) in einem p-MAP-Standard (pink).

Diese Beispiele verdeutlichen, dass die UHPLC mit UV-Detektion immer noch eine starke Technik komplementär zur Massenspektrometrie ist. Die hier vorgestellten Verbindungen sind durch das identische Masse-zu-Ladung-Verhältnis (m/z) nicht mit einem Massenspektrometer unterscheidbar und die kleine Verunreinigung des p-MAP-Standards in Abbildung 5 Teil C ist nicht detektierbar.

* C. Kuhlmann Shimadzu Deutschland GmbH, 47269 Duisburg

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