HILIC-Tipps, Teil 4 Die mobile Phase: passende Lösungsmittel in HILIC finden

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Wie finde ich das beste Lösungsmittel für mein HILIC-Setting? Was erleichtert die Methodenentwicklung? Und warum ist die Rekonditionierungszeit bei HILIC nur selten ein Hindernis? Im vierten HILIC-Tipp dreht sich alles um die mobile Phase bei der hydrophilen Interaktionschromatographie.

In HILIC können schon kleinste Änderungen der Laufmittelzusammensetzung wesentliche Verschiebungen in der Retentionszeit bewirken. Gerade vor dem Hintergrund, dass wir das aus der RPLC nicht so ausgeprägt kennen, sollte man ein besonderes Augenmerk auf Auswahl und Herstellung der Laufmittel legen. Dabei ist es wichtig zu wissen, dass in der HILIC der Einfluss auf die Retention generell von folgenden Parametern in der mobilen Phase abhängt [1]:

I) Gehalt an organischem Lösungsmittel > II) Salzgehalt ~ III) pH-Wert > IV) Säulentemperatur

Demnach ist bei der Methodenentwicklung der Anteil des organischen Lösungsmittels in der mobilen Phase der zentrale erste Optimierungsschritt. Im weiteren Verlauf erfolgt üblicherweise die Optimierung des Gradientenprofils.

Elutionsreihenfolge der Laufmittel

Wie in den HILIC-Tipps 1 (RPLC oder HILIC) und 2 (Retention & Elution) beschrieben, besteht die mobile Phase in der HILIC zu Beginn aus einer Mischung von zwei bis fünf Prozent Wasser und einem entsprechend hohen Anteil wassermischbaren organischen Lösungsmittels. Zu beachten ist dabei die jeweilige Elutionskraft der HILIC-Lösungsmittel, denn diese ist – anders als in der RPLC – in der folgenden Reihenfolge abnehmend [2]:

Wasser > Methanol > Ethanol > Isopropanol > Tetrahydrofuran > Acetonitril

Acetonitril ist als aprotisches Lösungsmittel das am häufigsten eingesetzte organische Laufmittel in der HILIC. Aufgrund seiner vergleichsweise geringen Elutionskraft ermöglicht es eine ausgeprägte Retention polarer Analyten und stellt daher in der Regel den bevorzugten Ausgangspunkt für die Methodenentwicklung dar.

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Die Rolle von Wasser in der mobilen Phase

Neben Acetonitril können auch andere wassermischbare organische Lösungsmittel verwendet werden, darunter verschiedene Alkohole oder zyklische Ether. Alkohole besitzen eine deutlich höhere Elutionskraft und führen häufig zu einer reduzierten Retention der Analyten. Ihr Einsatz beschränkt sich daher meist auf Anwendungen, bei denen sehr starke Wechselwirkungen zwischen Analyt und stationärer Phase abgeschwächt werden sollen.

Zur Erinnerung: Unabhängig von den übrigen chromatographischen Parametern gilt in der HILIC eine grundlegende Regel: Eine Zunahme der Retention von Analyten geht mit einem steigenden Anteil des organischen Lösungsmittels in der mobilen Phase einher.

Im Gegensatz zur RPLC ist Wasser, wie bereits oben beschrieben, in der HILIC das Lösungsmittel mit der höchsten Elutionskraft. Der Wassergehalt sollte allerdings trotzdem mindestens zwei Prozent in der mobilen Phase betragen. Somit ist sichergestellt, dass sich auf der Oberfläche der stationären Phase eine Wasserschicht ausbilden kann, die es Analyten erlaubt, darin gelöst zu werden. Anschließend wird die Elution von Analyten durch eine Erhöhung des Wassergehaltes in der mobilen Phase auf 40 % ermöglicht. Der hier zugrunde liegende Mechanismus ist in Tipp 2 beschrieben und in HILIC-Trennungen stark dominierend.

Tipps zur Methodenentwicklung

Ein typischer erster Gradient zur Entwicklung einer HILIC-Trennung ist in Abbildung 2 dargestellt. Der Elutionsgradient besteht aus einer Wasser/Acetonitril-Mischung und steigt nach einer kurzen isokratischen Phase zu Beginn der Methode linear bis auf 40 % Wassergehalt an. Dies kann dann als Ausgangspunkt für eine folgende, gegebenenfalls sehr „kleinteilig“ werdende Methodenentwicklung genutzt werden. Auf diese Weise lässt sich ein erster Eindruck vom Retentionsverhalten der zu trennenden Substanzen gewinnen. Gleichzeitig liefert dies wertvolle Hinweise darauf, welche Parameter für die weitere Methodenentwicklung besonders relevant sind und wie diese zielgerichtet und effizient optimiert werden kann.

Die Retention in der HILIC wird – wie erwähnt – wesentlich stärker durch Änderungen der Lösungsmittelzusammensetzung beeinflusst als in der RPLC. Aus diesem Grund haben wir die folgenden Empfehlungen zusammengestellt, die Sie in einer konkreten Methodenentwicklung berücksichtigen sollten:

• Probenlösungsmittel: Halten Sie den Gehalt an Acetonitril je nach Analyt im Probenlösungsmittel so hoch wie möglich. Methanol bis zu 20 % kann die Löslichkeit des Analyten unterstützen. Auf jeden Fall sollte der Wassergehalt im Probenlösungsmittel unter 5 % bleiben!

• Waschlösungen im System: Verwenden Sie immer Acetonitril mit 5 bis 10 % Wasser ohne Zusatz von Säuren oder Salzen.

• Vorgemischte Laufmittel: Die Retention bei HILIC verändert sich teilweise auch bei kleinen Änderungen des Wassergehaltes schon sehr drastisch. Die Nutzung von vorgemischten Acetonitril/Wasser-Lösungen hilft, die Reproduzierbarkeit der Analysen zu erhöhen.

• Säulen-Äquilibrierung bzw. -Rekonditionierung: Im Vergleich zu RPLC sind in der HILIC größere Äquilibrierungsvolumina notwendig. Typischerweise stellen erst zwanzig oder mehr Säulenvolumina die vollständige Äquilibrierung der HILIC-Säule sicher.

Rekonditionierungszeiten verkürzen

Die oft diskutierten Rekonditionierungszeiten in der HILIC stellen in der Praxis nur selten eine wesentliche Einschränkung dar, da verschiedene praktikable und wirksame Ansätze zur Verfügung stehen, um den Zeitaufwand deutlich zu verkürzen. Im vorherigen Abschnitt wurde die Äquilibrierung anhand von Säulenvolumina beschrieben. Bei einer gepackten Säule mit der Dimension von 2,1 x 150 mm beträgt das Volumen ca. 0,35 mL (abhängig von der Partikelgröße, etc.). Für die Äquilibrierung sollten nun mindestens zwanzig Säulenvolumina verwendet werden, was in diesem Beispiel 7,0 mL entspricht.

Die Beispielmethode in Abbildung 2 verwendet eine Flussrate von 0,4 mL/min. Damit wären 17,5 min Reäquilibrierungszeit notwendig. Da die Volumina zur Äquilibrierung bei erhöhter Flussrate schneller erreicht werden, kann man hier eine Flussratenerhöhung in Betracht ziehen. Die niedrigere Viskosität von Acetonitril führt auch bei höheren Flussraten nur selten zu Druckproblemen. Somit wird die oft beschriebene stark erhöhte Äquilibrierzeit umgangen, denn solange die Geschwindigkeit des Laufmittels nicht die Transfermöglichkeit von Wassermolekülen an die Partikeloberfläche verhindert gilt: Es geht es um das Volumen und nicht um die Zeit.

Erhöht man bei obigem Beispiel die Flussrate zur Äquilibrierung von 0,4 mL/min auf 0,8 mL/min dann benötigt man nur noch knapp neun Minuten zur vollständigen Reäquilibrierung. Das verkürzt zwar die Zeit, aber zugegebenermaßen nicht den Lösungsmittelverbrauch. Für Letzteres müssten Sie den folgenden Tipp (für Experten) nutzen.

Kleiner Geheimtipp zum Schluss (für Profis)

Apropos Verbrauch: Es ist möglich, in kürzerer Zeit bei konstanter Flussrate zu äquilibrieren, sodass weniger als zwanzig Säulenvolumina erforderlich sind. Dies führt zu einem so genannten dynamischen Gleichgewicht und kann bestenfalls ebenso reproduzierbare Ergebnisse liefern. Hierbei muss aufgrund der unvollständigen Äquilibrierung allerdings sichergestellt sein, dass die Äquilibrierungszeit, die Injektionszeitpunkte (mit -volumen und -länge) und die Flussrate zwischen den Läufen immer exakt gleichgehalten werden. Dies sei allerdings nur erfahrenen HILIC-Profis empfohlen.

In den kommenden Tipps beschäftigen wir uns zusätzlich zu dem hier beschriebenen I) Gehalt an organischem Lösungsmittel natürlich auch mit II) Salzgehalt, III) pH-Wert und IV) Säulentemperatur.

Literatur

[1] G. Greco and T. Letzel: Main interactions and influences of the chromatographic parameters in HILIC separations (pdf), Journal of Chromatographic Science, 2013, 51 (7), 684-693.

[2] A.E. Karatapanis, Y.C. Fiamegos, C.D. Stalikas: A revisit to the retention mechanism of hydrophilic interaction liquid chromatography using model organic compounds. Journal of Chromatography A, 2011, 1218 (20), 2871-2879.

Zu den anderen HILIC-Tipps

HILIC-Tipps, Teil 1

Ein Plädoyer für HILIC – die unterschätzte Methode der LC

HILIC-Tipps, Teil 2

Retention und Elution bei HILIC vs. RPLC

HILIC-Tipps, Teil 3

Welche stationären Phasen nutzt man für HILIC?

Die Autoren

Dr. Thomas Letzel: Gründer und Geschäftsführer, Analytisches Forschungsinstitut für Non-Target Screening GmbH (AFIN-TS), www.afin-ts.de

Thomas Letzel wurde zum Chemielaboranten ausgebildet, studierte im Anschluss Chemie und promovierte in der Umweltanalytik. Danach erfolgten analytische Forschungsaufenthalte in Amsterdam und in München (an der TUM; wo er seit 2009 auch als Privatdozent „Analytische Chemie und Bioanalytik“ unterrichtet). Er forscht und berät seit 2018 (im Gründertrio) mit seinem eigenen Forschungsinstitut und hat es sich zur Aufgabe gemacht, HILIC als HPLC-Methode stärker in den analytischen Alltag zu holen.

Dr. Stefan Bieber: Gründer und Geschäftsführer, Analytisches Forschungsinstitut für Non-Target Screening GmbH (AFIN-TS)

Gemeinsam mit Thomas Letzel leitet Stefan Bieber die AFIN-TS GmbH als Geschäftsführer und beschäftigt sich seit vielen Jahren mit dem Non-Target Screening.

Dr. Annette Dibowski: Geschäftsführerin, Dichrom GmbH, www.dichrom.com

Annette Dibowski ist nicht nur Geschäftsführerin von Dichrom und Sales Consultant bei Biotech Fluidics, sondern auch leidenschaftliche „Polarforscherin“ in der Chromatographie polarer Verbindungen.

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