HILIC-Tipps, Teil 2 Retention und Elution bei HILIC vs. RPLC

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Was unterscheidet HILIC von einer „umgekehrten Umkehrphasenchromatographie“? Dieser Beitrag blickt auf den Retentionsmechanismus von HILIC und erklärt, welche Rolle die immobilisierte Wasserschicht auf der stationären Phase spielt.

Die Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography, kurz HILIC kann zur Trennung von sehr polaren Molekülen genutzt werden, die auf keiner stationären Phase der RPLC zurückgehalten werden. Sie wird oft als „umgekehrte Umkehrphasenchromatographie“ dargestellt, doch das trifft nicht den Kern dieser Methode.

Was aber an HILIC prinzipiell so anders? Oder präziser formuliert: Welche Retentionsmechanismen wirken in HILIC auf polare Moleküle? Auf diese grundsätzliche Frage lässt sich eine sehr einfache und praktikable Antwort finden, denn die Haupteigenschaften des Trennmechanismus in HILIC wurden bereits theoretisch geklärt. Sie sind klar benannt und können im Labor praktisch und direkt umgesetzt werden [1].

Eine gute Vorhersage der Trennung ist bisher allerdings immer noch lückenhaft durchführbar, da die Faktorisierung, d.h. die Gewichtung der einzelnen mechanistischen Parameter, nicht direkt anteilig erfolgen kann. Das liegt daran, dass die Retentionsmechanismen von HILIC im Vergleich zu anderen chromatographischen Trenntechniken etwas komplexer sind. Wie in Abbildung 2 (in Anlehnung an eine Abbildung von B. Buszewski and S. Noga [2]) zu sehen ist, ist die stationäre Phase klar der Normalphasenchromatographie (NPLC) entlehnt, sowie die mobile Phase der Umkehrphasenchromatographie (siehe hierzu auch die Erklärungen in HILIC-Tipps, Teil 1).

Schwieriger wird es mit der Klärung des Retentionsmechanismus der entsprechenden Analyten (die Buszewski im Jahr 2012 ausschließlich mit Ionenaustauscheigenschaften erklärte [2]). In den darauffolgenden Jahren wurde – vor allem für ungeladene polare Substanzen – ein weiterer Faktor als relevant mit aufgenommen, nämlich der der Flüssig-Flüssig-Verteilung [1]. Genauer gesagt beschreibt sich diese Verteilung als Phasentransfer der Analyten zwischen der (zunächst Molekül- lösenden) mobilen Phase und immobilisierter Wasserschicht auf der Oberfläche der stationären Phase. Ist ein Analyt schließlich in der immobilisierten Wasserschicht gelöst, so kann dieser darin elektrostatische Wechselwirkungen (zum Beispiel mittels Ionenaustauscheffekte) und adsorptive Wechselwirkungen (zum Beispiel durch Wasserstoffbrückenbindungen) mit funktionellen Gruppen der stationären Phase ausbilden (sofern die stationäre Phase dies erlaubt).

Demzufolge arbeiten auch heute noch Forschergruppen an der Wichtung bzw. Faktorisierung von wesentlichen Effekten in/mit unterschiedlichsten stationären Phasen und somit an deren Einflüssen auf die Retention verschiedener Moleküle. Das Spektrum reicht von den so genannten ERLIC-Eigenschaften (Electrostatic Repulsion Liquid Chromatography) [3] bis hin zu kürzlich diskutierten, fortschrittlichen Ansätzen zur anspruchsvollen HILIC-Analyse intakter Proteine [4].

Hierzu gibt es bereits einige gute Modellierungsansätze und experimentelle Untersuchungen. Diese werden oft als Mixed-Mode-Mechanismus (bitte nicht verwechseln mit der Mixed-Mode-Phase!) beschrieben, in denen gleichzeitig verschiedene Arten von Interaktion zur Retention der einzelnen Moleküle beitragen (siehe z.B. [5,6]).

Retention im Flüssig-Flüssig-System bei RPLC

Um aber den HILIC-Mechanismus wirklich praktisch zu verstehen, ist es zielführend, sich das wichtigste Retentionsmodell einmal näher anzusehen. Dieses wird bisher meist für die weitverbreitete Reversed-Phase Liquid-Chromatography (RPLC) genutzt und ist gut bekannt: RPLC beruht auf der Nutzung von hydrophoben stationären Phasen (RP-Phase), beispielsweise C18, sowie dem anfänglichen Einsatz von hochwässrigen mobilen Phasen.

Wie in Abbildung 3 zu sehen, bilden die Kohlenwasserstoffketten auf der Oberfläche der stationären RP-Phase eine hydrophobe Umgebung in Kontakt mit der hydrophilen mobilen Phase. Solch ein System kann auch als Flüssig-Flüssig-Trennsystem verstanden werden, in welchem die Retention durch die Verteilung des Analyten zwischen beiden Phasen resultiert. Somit, kann man die RPLC-Retention als die „Verteilung“ der Stoffe zwischen der hydrophoben Oberfläche der stationären Phase und der hydrophilen Umgebung der wässrigen mobilen Phase verstehen.

Die Löslichkeit in der einen Phase statt in der anderen wird bestimmt durch die Polarität des Analyten, zum Beispiel durch den log D oder log P (siehe auch HILIC-Tipps, Teil 1). Unpolare Komponenten sind in einer hydrophoben Umgebung besser löslich (genauer gesagt werden sie adsorbiert) und verweilen deshalb auch bevorzugt auf der RP-Phase. Nimmt der Gehalt an organischem Lösungsmittel in der mobilen Phase zu, so ist der Polaritätsunterschied zwischen stationärer und mobiler Phase nicht mehr so ausgeprägt und die unpolaren Moleküle gelangen nach und nach, je nach eigener Hydrophobizität, in die mobile Phase, sodass sie letztlich von der HPLC-Säule eluieren.

Dasselbe Verteilungsmodell lässt sich ebenso erfolgreich zur Beschreibung der Retention auf HILIC-Phasen heranziehen. Es ist allerdings erneut wichtig festzuhalten, dass hier alles exakt umgekehrt funktioniert.

Die Wasserschicht als Trennphase bei HILIC

Zusätzlich ist zu betonen, dass die Verteilung in HILIC nicht direkt zwischen mobiler Phase und Oberfläche der stationären Phase stattfindet. Eine schematische Beschreibung der Retention von polaren Analyten durch eine stationäre HILIC-Phase zeigt Abbildung 4.

Trennungen mit HILIC basieren auf der Nutzung von polaren stationären Phasen, die mit stark hydrophober mobiler Phase umspült werden. Die mobile Phase setzt sich oft aus Acetonitril mit wenigen Prozentanteilen an Wasser zusammen. Beide Lösungsmittel sind zwar gut mischbar, aber die Wassermoleküle wechselwirken bevorzugt mit der polaren Oberfläche der stationären Phase (meistens über Wasserstoffbrückenbindungen). Polare stationäre Phasen reichern somit Wasser aus der mobilen Phase an der Oberfläche an. Unter diesen Bedingungen stellt sich schlussendlich ein Eluentengradient ein, der von einer oberflächennahen Wasserschicht bis zu einem Acetonitril-reichen Eluenten reicht. Es kommt gewissermaßen zu einer „Zwischen“-Phase zwischen mobiler und stationärer Phase in der HILIC.

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Faktor Äquilibrier-Volumen und Gradient

Das Vorhandensein dieser – an der Oberfläche der hydrophilen stationären Phase adsorbierten und somit immobilisierten – Wasserschicht ist der wichtigste Faktor im Konzept der HILIC-Retention: Die wasserreiche Schicht und die acetonitrilreiche mobile Phase stellen hier das Flüssig-Flüssig-Trennsystem dar. Dies ist einer der zentralen Aspekte für erfolgreiche und reproduzierbare HILIC-Trennungen. Das vollständige Ausbilden dieser Wasserschicht benötigt Zeit (bzw. „Säulenvolumina“). Daher ist die Reäquilibrierung der stationären Phasen zwischen zwei Analysen in HILIC essenziell. Sollten Sie in der Vergangenheit schon einmal erfolglos versucht haben, Analyten reproduzierbar mit HILIC zu trennen, dann könnte dies einer der Gründe sein. Mehr hierzu erfahren Sie später in Teil 8 dieser Serie.

Der HILIC-Retentionsmechanismus wird also durch die Verteilung des Analyten zwischen diesen beiden Phasen auf der Grundlage ihrer entsprechenden Löslichkeit bestimmt. Im Gegensatz zu RPLC werden polare, hydrophile Analyten stark zurückgehalten, da sie sich bevorzugt in der Wasserschicht lösen. Der zunehmende Wassergehalt im Gradientenlauf der mobilen Phase führt zu abnehmenden Unterschieden in der Polarität von Lösungsmittel und immobilisierter Wasserschicht. Dies führt zu verstärkter Löslichkeit der Analyten in der mobilen Phase und somit zu deren Elution. Ab einem bestimmten Wassergehalt löst sich die Wasserschicht sogar komplett auf und die Verteilung findet nur noch zwischen mobiler Phase und den polaren Oberflächen der stationären Phase statt, was eine direkte veränderte Verteilung zur Folge hat.

Weitere trennungsrelevante Wechselwirkungen

Neben der Verteilung spielen in der HLIC-Trennung aber auch nichtkovalente Interaktionen der Analyten mit funktionellen Gruppen der stationären Phase eine bedeutende Rolle. Gelöste Moleküle mit Proton-Donor- oder Proton-Akzeptor-Eigenschaften können direkt mit der polaren Oberfläche der stationären Phase durch Wasserstoffbrückenbindungen wechselwirken. Im Falle geladener Analyten beeinflussen auch elektrostatische Wechselwirkungen die Retention der Analyten.

Diese Interaktionen zwischen Analyten und stationärer Phase können je nach Ladungszustand anziehend oder abstoßend sein. So können etwa elektrostatische Anziehungskräfte zwischen positiv geladenen Kationen und einer negativ geladenen stationären Phase ausgebildet werden, aber auch andersherum. Diese erhöhen konsequenterweise die Retentionszeit des Analyten auf der stationären Phase. Allerdings stoßen sich gleichgeladener Analyt und stationäre Phase ab, was im Vergleich zu einer erniedrigten Retentionszeit führen kann. Dies kann beispielsweise durch den pH-Wert der mobilen Phase beeinflusst sein, aber auch durch die Zugabe von Salzen oder Puffern in die mobile Phase. Diese Aspekte werden in den folgenden Tipps noch näher beleuchtet werden.

Literatur

[1] G. Greco and T. Letzel: Main interactions and influences of the chromatographic parameters in HILIC separations, Journal of Chromatographic Science, 2013, 51 (7), 684-693.

[2] B. Buszewski and S. Noga: Hydrophilic interaction liquid chromatography (HILIC)—a powerful separation technique. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2012, 402, 231–247.

[3] A. Alpert: Electrostatic Repulsion Hydrophilic Interaction Chromatography for Isocratic Separation of Charged Solutes and Selective Isolation of Phosphopeptides. Analyical Chemistry, 2008, 80(1), 62-76.

[4] S. Tengattini, G. Massolini, F. Rinaldi, E. Calleri, C. Temporini: Hydrophilic interaction liquid chromatography (HILIC) for the analysis of intact proteins and glycoproteins. Trends in Analytical Chemistry 174 (2024) 117702

[5] E. Tyteca, S. Bieber, T. Letzel, and G. Desmet: Possibilities and limitations of computer-assisted method development in HILIC: a case study. Chromatographia, 2016, 80, 771-781.

[6] M. Hemida, I.A.H. Ahmad, R.C. Barrientos, E.L. Regalado: Computer-assisted multifactorial method development for the streamlined separation and analysis of multicomponent mixtures in (Bio) pharmaceutical settings. Analytica Chimica Acta, 2024, 1293, 342178.

Zu den anderen HILIC-Tipps

HILIC-Tipps, Teil 1

Ein Plädoyer für HILIC – die unterschätzte Methode der LC

Die Autoren

Dr. Thomas Letzel: Gründer und Geschäftsführer, Analytisches Forschungsinstitut für Non-Target Screening GmbH (AFIN-TS), www.afin-ts.de
Thomas Letzel wurde zum Chemielaboranten ausgebildet, studierte im Anschluss Chemie und promovierte in der Umweltanalytik. Danach erfolgten analytische Forschungsaufenthalte in Amsterdam und in München (an der TUM; wo er seit 2009 auch als Privatdozent „Analytische Chemie und Bioanalytik“ unterrichtet). Er forscht und berät seit 2018 (im Gründertrio) mit seinem eigenen Forschungsinstitut und hat es sich zur Aufgabe gemacht, HILIC als HPLC-Methode stärker in den analytischen Alltag zu holen.

Dr. Stefan Bieber: Gründer und Geschäftsführer, Analytisches Forschungsinstitut für Non-Target Screening GmbH (AFIN-TS)
Gemeinsam mit Thomas Letzel leitet Stefan Bieber die AFIN-TS GmbH als Geschäftsführer und beschäftigt sich seit vielen Jahren mit dem Non-Target Screening.

Dr. Annette Dibowski: Geschäftsführerin, Dichrom GmbH,www.dichrom.com
Annette Dibowski ist nicht nur Geschäftsführerin von Dichrom und Sales Consultant bei Biotech Fluidics, sondern auch leidenschaftliche „Polarforscherin“ in der Chromatographie polarer Verbindungen.

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