Kennen Sie HILIC? Und nutzen Sie es? Wenn Ihre Antwort „nein“ lautet, sind Sie hier genau richtig. Denn womöglich verpassen Sie eine analytisch elegante Trennmethode für Ihre Proben. Deshalb: vergessen Sie alle Vorurteile und tauchen Sie ein in eine unterschätzte Trennmethode für (sehr) polare Moleküle.
Abb.1: Der erste Teil der HILIC-Tipps beschäftigt sich u.a. mit den Grundlagen von Polarität und gibt Auswahlhilfen für die Frage: RPLC oder HILIC?
(Bild: VCG – Lüttmann)
Die HILIC-Tipps sind eine Artikelserie, die freundlicherweise von Dr. Thomas Letzel und weiteren Mitstreitern bereitgestellt wird (s. Autoreninfo am Ende). Die Beiträge sollen die Scheu vor der Methode nehmen und analytische Potenziale aufzeigen. Es handelt sich um eine aktualisierte Version bereits verfügbarer Praxistipps. Im Laufe des Jahres 2026 werden weitere Teile folgen.
Einleitung
Do you HILIC? – Diese Frage stellen wir nun regelmäßig seit über 15 Jahren. Die Antwort darauf lautet nach wie vor meistens „Nein“. Und das, obwohl wir direkt zu Beginn unserer Wissensvermittlung für die Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography , kurz HILIC, eine „Charme-Offensive“ starteten. Obwohl wir seither dessen Nutzung und Einsatz mit zahlreichen praxisorientierten HILIC-Seminaren, gebuchten In-House-Schulungen sowie unterschiedlichen Workshops unterstützen. Und obwohl es viele kostenfreie Handlungsanweisungen gibt, die wir von Anfang an in deutscher und in englischer Sprache zur Verfügung stellen. So veröffentlichen wir neben Handlungsanweisungen [1] auch Tipps [2] und Solutions [3]. Die Information der Quellen [1] und [3] steht bis heute direkt und kostenfrei (sowie ohne Registrierung und digitaler Erfassung) zum Download zur Verfügung.
Bei der Einstiegsfrage geht es bis heute eben um weit mehr, als „nur“ (sehr) polare Moleküle chromatographisch voneinander zu trennen. Es geht auch um Angst. Und diese gilt es zu überwinden. Aus diesem Grund beschlossen wir, eine Neuauflage der HILIC-Tipps zu realisieren und mit bekannten sowie aktualisierten Inhalten „das Fass noch einmal aufzumachen“. Das Ziel ist klar: Wir wollen im neuen Konsortium allen Chromatographie-Interessierten das Wissen und Selbstvertrauen geben, HILIC nun als gleichwertige Technologie zur Umkehrphasenflüssigchromatographie (RPLC), Ionenchromatographie (IC) und Gasphasenchromatographie (GC) einzusetzen. Denn das Portfolio des eigenen Labors wird damit extrem effizient erweitert.
Wir blicken also erneut auf unser eigenes Ja zur HILIC und wollen sicherstellen, dass die Trenntechnik – nach der Stabilisierungsphase der letzten eineinhalb Jahrzehnte – jetzt auch in die Breite der instrumentellen Analytik findet. So kann (gerne auch mit unserer Hilfe) die große Gruppe der sehr polaren – und somit hervorragend wasserlöslichen – Moleküle (häufig in wässriger Matrix) zielführender und robuster analysiert werden.
HILIC-Charme-Offensive 2.0
Um nun aktuellen Entwicklungen Rechnung tragen zu können, starten wir abermals die HILIC-Charme-Offensive 2.0 mit „Grundlagen und Tipps“ in der Online-Version von LABORPRAXIS. Es gibt also 2026 ein Remake zu „Grundlegendes zur Hydrophilen Interaction Liquid Chromatography“ welches keine Fragen mehr offenlassen sollte.
Bei HILIC-Fragen und Unbehagen kontaktieren Sie gerne die Verantwortlichen für diese Tipps direkt über deren Homepage; dann lässt sich das Unbehagen beheben. www.afin-ts.de und www.dichrom.com
(Bild: AFIN-TS)
Wir hoffen, dass wir dadurch den nach wie vor etwas „angeknacksten Ruf“ von HILIC jetzt final ausräumen können.
Zunächst sei an dieser Stelle aber unserer ehemaligen Kollegin Dr. Giorgia Greco noch ein herzlicher Dank ausgesprochen, denn sie brachte die frühe Klärung des HILIC-Mechanismus voran (z. B. die der zwitterionischen Phasen [4]) und verfasste einen Großteil der ursprünglichen HILIC-Texte [1-3]. Giorgia, herzlichen Dank und Granni grazzî.
Alte Vorurteile ablegen
Zurück zur eingangs gestellten Frage „Do you HILIC?“ und der oftmals spontan gegebenen Antwort „Nein“. Dabei hören wir Sätze wie:
„Nein, HILIC ist instabil und nicht reproduzierbar!“
„Die Peaks sind in HILIC so breit und ich kann kein Wasser injizieren!“
„Eine Rekonditionierung der Phase dauert ewig und die Methodenentwicklung ist kompliziert.“
Chromatographisch erfahrenere Analytiker geben uns hierzu oft eher ausweichende Antworten:
„Ich kann polare Moleküle ja auch mit polaren RPLC-Säulen trennen.“ (gemeint sind hierbei meist, non-endcapped, polar-endcapped oder polar-embedded C18-Phasen)
„Ich bevorzuge Ionenchromatographie!“
„Ich habe gehört, dass CE (Kapillarelektrophorese) mittlerweile gut gehen soll“
„Wir haben da eine GC-Methode mit Derivatisierung.“
Um sich des Themas unbedarft annehmen zu können, bitten wir Sie zunächst einmal, alle ausweichenden Antworten, negativen Vorurteile oder Erfahrungen über Bord zu werfen und sich den nachfolgend beschriebenen physiko-chemischen Sachverhalten unvoreingenommen zu nähern. Wir empfehlen, sich diese Tipps gegebenenfalls auch gleich ausgedruckt, unter das Kopfkissen oder noch besser auf die Bench zu legen, und die Tipps in der kommenden Zeit selbst auszuprobieren. Dann gibt es kein Hören-Sagen mehr und es wird schnell klar, dass man HILIC nicht einfach als „umgekehrte Umkehrphasenchromatographie“ sehen und betreiben sollte, sondern dass sie eine Trenntechnik mit eigenem Mechanismus darstellt!
Gleichzeitig erörtern wir auch die Möglichkeiten und Unmöglichkeiten dieser Technik. Wir sind uns sicher, danach werden die Skepsis bzw. Ablehnung gegenüber dieser Technik verschwunden sein. Das zeigt jedenfalls unsere Erfahrung mit den Personen aus den Kursen, dem direkten Laborumfeld und dem weiteren Umfeld chromatographischer Labore. Vielleicht geht Ihr Wissensdurst auf polare Trennungstechniken dann ja sogar so weit, dass Sie sich auch für die SFC, also Chromatographie mit überkritischem Kohlenstoffdioxid interessieren [5].
Stand: 08.12.2025
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Die HILIC ist also ein sehr effektives Werkzeug und kann zur Trennung von sehr polaren Molekülen genutzt werden, die auf keiner stationären Phase der RPLC zurückgehalten werden. Ihre Wurzel reicht zurück in die 1990er Jahre. Zur damaligen Zeit gab es die Normalphasenchromatographie für polare und die Umkehrphasenchromatographie für unpolare Analyten.
Da in der Normalphasenchromatographie aber nur (teils sehr) unpolare Lösungsmittel zum Einsatz kommen und diese in der Regel nicht mit Wasser mischbar sind, war hier schnell eine Limitierung für wasserlösliche Verbindungen erkennbar. Diese Schwäche der Normalphasenchromatographie wurde damals durch die HILIC kompensiert.
Man nutzt hier zwar die stationären Phasen der Normalphasenchromatographie, also polare Phasen, verwendet aber die mobilen Phasen der Umkehrphasenchromatographie, Wasser und ein wassermischbares organisches Lösungsmittel, allerdings in umgekehrtem Verhältnis. Das sorgte dafür, dass HILIC auch als „umgekehrte RPLC“ (reversed-RPLC) bezeichnet wurde. Als erster führte der im Jahre 2023 verstorbene Andrew Alpert diese Beschreibung von HILIC im Jahr 1990 ein und beschrieb sie als eine Variante der Normalphasenchromatographie (NPLC) mit niedrigviskosen polaren Laufmitteln der Umkehrphasenchromatographie (RPLC) [6].
Stationäre HILIC-Phasen sind dabei sehr polare Materialien, wie Silica oder daran chemisch gebundene polare funktionelle Gruppen. Die gemeinsame Charakteristik der Phasen ist die Fähigkeit, auf der Oberfläche der Partikel stark Wasser adsorbieren zu können. Hydrophile Komponenten werden dann vor allem deshalb auf den HILIC-Phasen zurückgehalten, weil sich diese bevorzugt in dieser Wasserschicht lösen können, wobei hydrophobe Komponenten dies nicht tun, da diese eben nicht gut in die Wasserschicht diffundieren, somit in der mobilen Phase verbleiben und früh eluieren.
Vorschau: Stationäre Phase bei HILIC – Die Wasserschicht an der stationären Phase ist einer der Schlüsselfaktoren für erfolgreiche Trennungen in HILIC. Wir werden uns deshalb in den folgenden Tipps noch intensiv mit diesem Thema beschäftigen.
Im Gradientenmodus starten die HILIC-Bedingungen bei einem hohen Prozentsatz an organischem Lösungsmittel wie Acetonitril, typischerweise 95 %, zur Induktion der Wasserschicht. Die anschließende Elution wird durch Erhöhung des Wassergehalts bis zu 40 % unterstützt. So ist auch die Umkehrung der Elutionsreihenfolge eine der ersten allgemeinen Erfahrungen, die man macht, wenn man HILIC-Säulen mit RPLC-Säulen vergleicht.
Trennungsbeispiel nach Polarität
Tabelle 1: Physiko-chemische Eigenschaften der untersuchten Analyten
(Bild: AFIN-TS)
Nehmen wir zur Illustration vier Moleküle mit unterschiedlicher Polarität, zum Beispiel:
Phenol
4-Hydroxybenzoesäure
Vanillinsäure
Syringasäure
Abb.2: Trennung von Phenol und Benzoesäuren jeweils auf einer RPLC- und einer HILIC-Phase. Chromatographische Bedingungen: RPLC: Säule, Fortis SpeedCore AQUA (100 x 3.0 mm, 2.6 µm), P/N: SPAQ-030526; Mobile Phase, 10 mM Ammonium Acetat, ACN; 2-10 min, von 0 bis 100% ACN; Flußrate: 0.4 mL/min; UV Detektion: 250 nm. HILIC: Säule, Fortis HILIC Diol (100 x 4.6 mm, 1.7 µm), P/N: FDI-05051; Mobile Phase, ACN, 10 mM Ammonium Acetat, von 5 bis 40% 10 mM Ammonium Acetat; Flußrate: 1.0 mL/min; UV Detektion: 250 nm.
(Bild: AFIN-TS)
Phenol ist sehr hydrophob und die Weiteren werden der Reihe nach immer hydrophiler (s. Tab. 1). Wie in Abbildung 2 zu sehen ist, wird Phenol auf einer konventionellen C18-RPLC-Säule sehr stark retardiert, während die drei 4-Hydroxybenzoesäuren nicht zurückgehalten werden. Allerdings werden die Benzoesäuren (injiziert) auf eine HILIC-Diol-Phase sehr viel stärker retardiert und Phenol dabei nicht zurückgehalten, das heißt, die Elutionsreihenfolge hat sich umgekehrt. Man sieht an der Reihenfolge der Benzoesäuren, dass die Substanzen umso später von der HILIC-Säule eluieren, je polarer die Moleküle sind. Um das zu verstehen und für die eigenen Analyten zu nutzen, werfen wir als nächstes einen Blick auf die Eigenschaft der Polarität.
Was sind polare Moleküle eigentlich?
Die Polarität von Molekülen hat viele Namen, wie Hydrophobizität, Hydrophilie oder auch Lipophilie. Ein gängiger Weg ist dabei, den Logarithmus des Oktanol-Wasser-Verteilungskoeffizienten (log Kow) zu bestimmen, der sich für ungeladene Moleküle als log P und für geladene Moleküle als log D (in Abhängigkeit des pH-Wertes) angeben lässt. Hierfür muss man die Löslichkeit einer (neutralen oder geladenen) Komponente in dem Lösungsmittel n-Oktanol im Vergleich zur Löslichkeit in Wasser wie folgt bestimmen:
Praktische Bestimmung von log D bzw. log P
1. In einem Scheidetrichter die zu untersuchende Komponente in den nicht-mischbaren Lösungen n-Oktanol und Wasser ausschütteln.
2. Anschließend den Gehalt der Komponente in jedem dieser Lösungsmittel bestimmen.
3. Hieraus das Verhältnis aus Substanzkonzentration in n-Oktanol zu Substanzkonzentration in Wasser bilden.
4. Ist dieses Verhältnis größer 1, so ist das Molekül unpolar. Ist das Verhältnis ein Bruchteil von 1, so ist das Molekül (sehr) polar.
5. Aus dem berechneten Verhältnis den Logarithmus bilden.
Abb.3: Grafische Darstellung der (pH-unabhängigen) log P Werte sowie der (pH-abhängigen) log D Werte in Abhängigkeit der Polarität von zu untersuchenden Analyten in der Chromatographie. Die Hydrophilie erhöht sich mit abnehmenden log P Wert bzw. log D Wert.
(Bild: AFIN-TS)
Besitzen Moleküle nun einen positiven Logarithmuswert, so ist das Molekül konsequenterweise unpolar, und ist der Logarithmuswert negativ, ist das Molekül (sehr) polar (s. Abb. 3 und Infokasten für die Gleichungen). Ein log D-Wert von 1 bedeutet somit, dass zehnmal so viele Moleküle der Verbindung in der Oktanolphase nachweisbar sind verglichen mit der Zahl in der Wasserphase.
Was ist der Unterschied zwischen log P und log D?
Für neutrale Analyten gilt der Logarithmus des Verteilungskoeffizienten
log P = log (cAnalyt in Oktanol/cAnalyt in Wasser)
wobei P definiert ist als das Verhältnis der Konzentrationen eines neutralen Analyten in n-Oktanol und Wasser im Gleichgewicht.
Geht es um geladene oder ladbare Analyten, wie Amine oder organische Säuren, kann sich die Polarität mit dem pH-Wert ändern. Zugleich können abhängig vom pH-Wert mehrere Spezies eines Analyten zeitgleich vorhanden sein, beispielsweise ist ein Teil aller Moleküle protoniert und ein anderer Teil deprotoniert. Geladene Analyten sind hydrophiler als ihre neutrale Form, und für diese gilt dann der pH-Wert-abhängige Logarithmus des Verteilungskoeffizienten, der alle Spezies (geladen und ungeladen) eines Analyten in den beiden Phasen berücksichtigt.
log D = log (caller Spezies des Analyten in Oktanol/caller Spezies des Analyten in Wasser)
wobei D definiert ist als das Verhältnis der Konzentrationen aller Spezies eines Analyten in n-Oktanol und der Konzentrationen aller Spezies des Analyten in Wasser bei einem gegebenen pH-Wert.
Abb.4: Schematische Darstellung von a) der Molekülspezies von Vanillinsäure in ihrer Abhängigkeit vom pH-Wert und b) die korrespondierenden log D-Werte bei entsprechenden pH-Werten.
(Bild: AFIN-TS)
Wichtig ist hierbei, dass geladene und ladbare Moleküle in unterschiedlichen Spezies vorliegen können. Je nach pH-Wert können beispielsweise Carboxylgruppen von Säuren protoniert oder deprotoniert vorliegen. Dies hat direkten Einfluss auf die Polarität des Moleküls. Zusätzlich können mehrere Spezies eines Moleküls zum selben Zeitpunkt in einer Lösung vorhanden sein, also z. B. zeitgleich mit protonierter und deprotonierter Carboxylgruppe. Das Verhältnis der Spezies zueinander und deren Vorhandensein in einer Lösung wird wiederum über den pH-Wert bestimmt (s. Abb. 4). Damit ändert sich auch der log D-Wert einer Verbindung in Abhängigkeit vom pH-Wert.
Tatsächlich ist die experimentelle Bestimmung des log P (für ungeladene Moleküle und pH-Wert unabhängig) bzw. log D (für ladbare Moleküle und pH-Wert abhängig) sehr aufwendig und deshalb werden diese heute meistens theoretisch über Modellierungen angegeben. Es gibt hierfür mehrere Softwarepakete, wobei an dieser Stelle zwei frei zugängliche Open-Access-Datenbanken benannt werden, die über Software berechnete log P- und log D-Werte beinhalten, nämlich https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/ und www.chemspider.com.
Entscheidungshilfe: RPLC oder HILIC nutzen?
Greifen wir noch einmal das Beispiel mit Phenol und die 4-Hydroxybenzoesäuren auf. Der pH-Wert der mobilen Phase der in Abbildung 2 gezeigten Trennungen ist neutral. Die Polarität des Analyten ist also – wie oben erklärt – der erste Parameter, den wir zur Erstellung der richtigen HPLC-Methode aufgreifen. Sowohl der Retentionsmechanismus der RPLC als auch der HILIC basiert auf dem Verteilungsprozess. Auch, wenn die Interaktionen jeweils einen anderen Ursprung haben, so kann die Methode aus der praktischen Sichtweise heraus doch perfekt über den log P- bzw. log D-Wert abgeschätzt werden (s. Tab. 1 und Kasten zum Unterschied zwischen log P und log D). Um eine grundsätzliche Einteilung vornehmen zu können, sei die obige Sichtweise benutzt:
log P oder log D > 0 bedeutet: RPLC verwenden
log P oder log D < 0 bedeutet: HILIC verwenden
Sind die Moleküle unpolar, das heißt, der log P bzw. log D sind positiv, so werden sie also normalerweise auf der RPLC retardiert und dort von anderen Substanzen getrennt. Sind die Moleküle nun aber polar, das heißt der log P bzw. log D sind negativ, so werden sie auf der HILIC retardiert und dort von anderen Substanzen getrennt. Aus der eigenen Erfahrung heraus (und unter Zuhilfenahme detaillierter Studien) können wir den chromatographischen Bereich heute in drei generelle Abschnitte einteilen [7].
Der Bereich log P bzw. log D > 2 sollte mit (unpolar endcapped) RPLC durchgeführt werden.
Der Bereich 2 > log P bzw. log D > -2,5 kann mit so genannten polar-embedded, polar-endcapped oder nicht endcapped RPLC-Materialien durchgeführt werden, denn diese erlauben noch in gewissem Maße polare Wechselwirkungen von Analyten und stationärer Phase.
Bei log P bzw. log D < -2,5 für alle Analyten eluiert Ihre Komponente vermutlich mit dem Initialvolumen der unterschiedlichen RPLC-Materialien. In diesem Fall nutzen Sie konsequenterweise Ionenchromatographie (erfasst geladene Moleküle) oder besser gleich HILIC (erfasst geladene und ungeladene Moleküle). Letzteres trennt Ihnen nämlich –wie beschrieben –sämtliche (sehr) polare Moleküle und nicht nur die (mittel)polaren oder ionischen.
Nehmen Sie jetzt also HILIC? Dann halten Sie am besten auch nach den nächsten Teilen dieser Artikelserie Ausschau und nehmen sich die dazugehörigen Tipps mit. Dann sind Sie gewappnet, entsprechend Ihrer Analyten eine HILIC-Methode optimal zu etablieren.
[2] S. Bieber, H.-G. Döteberg, G. Greco, S. Kromidas und T. Letzel: HPLC-Tipps Band 3 - Gradient, HILIC, SFC und Trends in der HPLC (Pirrot-Verlag; Editor: S. Kromidas), 22. November 2016, ISBN 978-3-937436-58-6.
[4] G. Greco, S. Grosse, and T. Letzel: Study of the retention behavior in zwitterionic hydrophilic interaction chromatography of isomeric hydroxy- and aminobenzoic acids. Journal of Chromatography A 2012, 1235, 60-67.
[6] A. J. Alpert: Hydrophilic-interaction chromatography for the separation of peptides, nucleic acids and other polar compounds. Journal of Chromatography, 1990, 499, 177-196.
[7] S. Bieber, G. Greco, S. Grosse, and T. Letzel: RPLC-HILIC and SFC with mass spectrometry: Polarity-extended organic molecule screening in environmental (water) samples. Analytical Chemistry, 2017, 89 (15), 7907-7914.
Wer sind „wir“? – Die Autoren
Dr. Thomas Letzel
(Bild: privat)
Dr. Thomas Letzel: Gründer und Geschäftsführer, Analytisches Forschungsinstitut für Non-Target Screening GmbH (AFIN-TS), www.afin-ts.de Thomas Letzel wurde zum Chemielaboranten ausgebildet, studierte im Anschluss Chemie und promovierte in der Umweltanalytik. Danach erfolgten analytische Forschungsaufenthalte in Amsterdam und in München (an der TUM; wo er seit 2009 auch als Privatdozent „Analytische Chemie und Bioanalytik“ unterrichtet). Er forscht und berät seit 2018 (im Gründertrio) mit seinem eigenen Forschungsinstitut und hat es sich zur Aufgabe gemacht, HILIC als HPLC-Methode stärker in den analytischen Alltag zu holen.
Dr. Stefan Bieber
(Bild: privat)
Dr. Stefan Bieber: Gründer und Geschäftsführer, Analytisches Forschungsinstitut für Non-Target Screening GmbH (AFIN-TS) Gemeinsam mit Thomas Letzel leitet Stefan Bieber die AFIN-TS GmbH als Geschäftsführer und beschäftigt sich seit vielen Jahren mit dem Non-Target Screening.
Dr. Annette Dibowski
(Bild: privat)
Dr. Annette Dibowski: Geschäftsführerin, Dichrom GmbH,www.dichrom.com Annette Dibowski ist nicht nur Geschäftsführerin von Dichrom und Sales Consultant bei Biotech Fluidics, sondern auch leidenschaftliche „Polarforscherin“ in der Chromatographie polarer Verbindungen.
Dr. Giorgia Greco
(Bild: privat)
Dr. Giorgia Greco: Head of Product Management and Technical Documentation, Berlin Heart GmbH Giorgia Greco leitet seit 2025 das Produktmanagement und die technische Dokumentation bei der Berlin Heart GmbH. Ihre Karriere umfasst Stationen bei Knauer und Thermo Fisher Scientific. Sie bringt 15 Jahre Erfahrung im Produktmanagement mit und war maßgeblich an den ursprünglichen HILIC-Tipps beteiligt.
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