Transportproteine Im Fokus der Wirkstoffforschung:Transportproteine

Der Stofftransport über Membranen gehört zu den wesentlichen Funktionen eines biologischen Systems. So rücken Transportproteine zunehmend in den Mittelpunkt der pharmakologischen Wirkstoffforschung. Dazu sind robuste und schnelle Methoden erforderlich, die Transporter zuverlässig analysieren.

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Ob Einzeller oder hoch entwickelter Organismus, zu den wesentlichen Funktionen jedes biologischen Systems gehört die Aufnahme und Abgabe von Stoffen. Wichtigste Barriere, die dabei überwunden werden muss, ist die Zytoplasmamembran der Zelle. Um den gezielten Stofftransport in die Zelle hinein und aus der Zelle heraus zu ermöglichen, sind in der Membran spezielle Proteine eingebettet. Man unterteilt diese Proteine in Kanäle und Transporter. Ein Kanal liegt meistens in Form einer Pore vor und vermittelt den passiven Transport entlang eines Gradienten. Ein Transporter verfügt hingegen über einen speziellen Mechanismus, mit dem ein Stoff aktiv, auch entgegen seines Gradienten, transportiert wird. Aktiver Stoffaustausch über Zellmembranen findet in jeder Zelle statt und ist immer mit physiologischen Prozessen verbunden. So wird zum Beispiel das Konzentrationsgefälle von Natrium- und Kaliumionen, die das Membranpotenzial hervorrufen, durch bestimmte Transporter eingestellt. Andere Transporter verwenden diese Gradienten, um bestimmte Stoffe wie Zucker oder Aminosäuren zu transportieren oder ihrerseits Gradienten anderer Ionen aufzubauen. In den meist komplexen Stoffwechselpfaden eines physiologischen Vorgangs stellen Transporter eine der kleinsten Einheiten dar. Sie sorgen unter anderem für den Transport von Nährstoffen aus dem Darm ins Blut, von Giftstoffen aus der Leber in die Galle, aber auch für die Ansäuerung des Magensaftes. Weiterhin vermitteln sie die Entfernung von Neurotransmittern aus dem synaptischen Spalt von Nervenverbindungen oder die Kalziumregulierung nach einer Muskelkontraktion. Ist ein solcher Stoffwechselpfad gestört, ist oft das Verhalten eines der beteiligten Transporter dafür verantwortlich. Daher sind Transporter auch pharmakologisch von Interesse.

Hürden der Wirkstoffforschung

Eine Vielzahl von Krankheiten wird direkt durch die Funktionsweise von Transportern beeinflusst. Die Wirkstoffforschung sucht daher nach Möglichkeiten, auf deren Aktivität einzuwirken und so den pathologischen Verlauf zu korrigieren. Eine Vielzahl potenzieller Wirkstoffe muss dabei zunächst auf ihr Transporteraktivität-steigerndes beziehungsweise -verringerndes Potenzial untersucht werden. In der klassischen Wirkstoffsuche bedient man sich dazu Hochdurchsatzverfahren. So lassen sich mit mehreren Tausend Wirkstoffen pro Tag entsprechende biochemische Tests durchführen. Oft kommen dabei radioaktive und fluoreszenzbasierende Methoden zum Einsatz. Diese Verfahren sind meist aufwändig und mit relativ hohen Kosten verbunden. Hinzu kommt, dass die Untersuchung von Transportern mit derzeit verfügbaren Hochdurchsatzsystemen sehr anspruchsvoll ist. Die Aktivität der Transporter ist zwar von enormer Bedeutung für den Zellstoffwechsel, sie ist jedoch relativ gering, wenn man sie mit der Aktivität anderer biologischer Komponenten, wie Enzymen oder Kanälen, vergleicht. Die Entwicklung spezieller hochdurchsatzfähiger Verfahren zur Messung von Transporteraktivitäten ist daher für die pharmakologische Wirkstoffsuche ein wichtiger Ansatz. Moderne elektrophysiologische Methoden stellen dabei eine Schlüsseltechnologie dar.

Alternativen zur Patch-Clamp-Technik

Mit der 1976 entwickelten Patch-Clamp-Technik stand erstmals ein Werkzeug zur selektiven und umfangreichen elektrophysiologischen Untersuchung von Kanälen und Transportern zur Verfügung. Dabei wird an ganzen Zellen oder Membranflecken einer Zelle das Potenzial auf beiden Seiten der Zytoplasmamembran abgegriffen. Liegt ein transportierter Stoff als Ion vor, ist seine Bewegung mit elektrischem Strom gleichzusetzen. Ein solcher Strom kann gemessen werden, wenn das System bewusst aus dem Gleichgewicht gebracht wird. Die Technik stellt jedoch sehr spezielle Anforderungen an die verwendeten Zellen. Testprotokolle müssen daher häufig mit hohem Optimierungsaufwand an ein bestimmtes Transportprotein angepasst werden. Die geringe Anzahl von gleichzeitig zur Verfügung stehenden Transportern begrenzt zudem die Empfindlichkeit der Methode. Um die notwendigen Substrate zur Verfügung zu stellen, erfordern Messungen an Transportern außerdem den Austausch von Lösungen. Zusammen mit der geringen mechanischen Stabilität wird ein solches System schnell anfällig gegenüber äußeren Einflüssen. Eine Alternative zur Patch-Clamp-Technik stellen elektrophysiologische Methoden auf der Basis von mechanisch sehr stabilen, festkörperunterstützten Hybridmembranen dar.

Stabile Aktivität auf solider Basis

Erfolgreiche Experimente mit festkörperunterstützten Membranen werden seit den 1990er Jahren durchgeführt. Die Hybridmembran besteht aus einer thiolisierten Goldschicht, auf die eine synthetische Lipidmonolage aufgebracht wird. Nach außen ähnelt diese Sandwichstruktur einer Zellmembran. Die Goldschicht auf der Innenseite ist ein elektrischer Leiter, von dem die induzierten Messströme abgenommen werden können. Zudem stabilisiert diese Schicht das System, stellt also die so genannte Festkörperunterstützung dar. Auf der Oberfläche der so gebildeten Sensoren lassen sich zellfreie Membranstrukturen immobilisieren, die den zu untersuchenden Transporter enthalten. Die Transporter können in Liposomen oder in nativen Membranvesikeln bzw. Membranfragmenten vorliegen. Für die eigentliche Messung wird der Sensor in ein fluidisches System eingebracht und über verschiedene Lösungen Substrat zugeführt. Um einen Strom detektieren zu können, muss das Substrat geladen vorliegen. Da die Aktivität des Transporters auf diese Weise mit einer Ladungstrennung verbunden ist, spricht man von einem elektrogenen Transportvorgang. Die Form der Anlagerung ist mechanisch sehr stabil. Daher kann mit hohen Flussraten gearbeitet werden und das System ist Störungen gegenüber unanfällig. Ein kommerziell verfügbares Gerät, das mit dieser Technologie arbeitet, ist der Surfe2r One (Surface Electrogenic Event Reader) von Iongate Biosciences. Besonders in der Pharmaindustrie ist neben der Robustheit eines Systems auch die Anzahl der erzielbaren Messpunkte pro Zeiteinheit ausschlaggebend.

Viele Daten in kürzester Zeit

Die Methode festkörperunterstützter Membranen lässt sich auf ein hochdurchsatzfähiges System übertragen. Die mechanisch stabilen Sensoren können in Form von Sensorarrays aufgebaut und im Format von standardisierten Mikrotiterplatten zur Verfügung gestellt werden. Für die Aktivierung des Transporters lassen sich Lösungen über eine automatisierte Injektionseinheit wechseln. Der komplette Aufbau ähnelt einem konventionellen Pipettierroboter. Die Surfe2r Workstation erzielt abhängig von der jeweiligen Fragestellung einen Durchsatz von bis zu 2000 Einzelmessungen pro Arbeitstag. Üblicherweise sind für eine Wirkstoffmessung im Rahmen eines Wirkstoffscreenings drei bis 15 Einzelmessungen erforderlich. So können bis zu 300 Wirkstoffe pro Arbeitstag auf ihre Wirkung an einem bestimmten Transporter getestet werden. Diese Daten gelten für eine Einkanalvariante, bei der eine Messung nach der anderen durchgeführt wird. In naher Zukunft soll auch ein System für parallele Messungen zur Verfügung stehen.

Unterm Strich

Hochdurchsatzfähige elektrophysiologische Messmethoden zur Untersuchung von Transportern sind wegen des zunehmenden Interesses an dieser Proteinklasse ein vielversprechendes Werkzeug. Festkörperunterstützte Membranen als Grundlage für zellfreie Sensoren stellen wegen ihrer hohen mechanischen Stabilität und Ro-bustheit eine geeignete Plattform dar, um in einem automatisierten System mit hohem Durchsatz eingesetzt zu werden. Die Surfe2r Technologie erlaubt neben dem Einsatz in der reinen Wirkstoffsuche auch pharmakologische Untersuchungen, wie die kinetische Charakterisierung von Wirkstoffen an bestimmten Transportern.

Hintergrund: Festkörperunterstützte Membranen und kapazitive Kopplung

Festkörperunterstützte Membranen sind Membranen, die an einem Festkörper befestigt sind. In den meisten Fällen wird als Festkörperunterstützung eine Goldoberfläche verwendet, die mit einem Thiol chemisch modifiziert wurde. Diese thiolisierte Goldschicht ist sehr hydrophob, sodass sich darauf eine synthetische Lipidmonolage abscheiden lässt. Die Membranstrukturen, die auf dieser Hybridmembran immobilisiert werden, befinden sich so dicht an der Goldoberfläche, dass eine Ladungsbewegung über deren Membran einen elektrostatischen Einfluss auf die freien Elektronen im Metall ausüben kann. Die Transporter-enthaltenden Membranen sind also kapazitiv an die festkörperunterstützte Membran gekoppelt. Der Transporter befördert Ladungsträger durch die Membran. Durch die resultierende Ladungstrennung entsteht in der Goldschicht eine entgegengesetzte Oberflächenladung. Das führt zu einem Strom, der im äußeren Messkreis als transientes Signal, ähnlich der Ladekurve einer Kapazität, detektierbar ist (s. Abbildung 4)

* Dr. R. Krause, IonGate Biosciences, 65926 Frankfurt am Main

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